大黃素對大鼠非酒精性脂肪肝及其糖脂代謝紊亂的防治作用

張亞輝，周伏喜，盧放根

（1.永州市中心醫院消化內科，湖南永州425000；2.中南大學湘雅二醫院消化內科，湖南長沙410011）

大黃素對大鼠非酒精性脂肪肝及其糖脂代謝紊亂的防治作用

張亞輝1，周伏喜2，盧放根2

（1.永州市中心醫院消化內科，湖南永州425000；2.中南大學湘雅二醫院消化內科，湖南長沙410011）

目的探討大黃素對大鼠非酒精性脂肪肝及其糖脂代謝紊亂的防治作用。方法SD大鼠隨機分為A組和M組，分別予普通飼料和高脂飼料喂養；于4周末驗證有脂肪肝后，M組再隨機分為B、C、D和E組，各大鼠飼養不變，其中，C、D、E組分別予低、高劑量大黃素、二甲雙胍干預。8周末測定肝指數、OGTT、轉氨酶、血脂及肝脂質含量，評價肝臟脂肪變和炎癥程度。結果C、D組肝指數和血ALT、AST均較B組降低(P＜0.01)。大黃素可改善糖耐量(P＜0.01)。與B組比較，大黃素能降低血TC、TG、LDL及降低肝TC、TG含量(P＜0.01)，均有劑量依賴關系(P＜0.01)；同時D組血HDL較B組升高(P＜0.01)。與B組比較，C、D組大鼠肝臟脂肪變有不同改善(P＜0.05，P＜0.01)，而肝臟炎癥均有改善(P＜0.01)。結論大黃素具有改善大鼠非酒精性脂肪肝及其糖脂代謝紊亂的作用。

非酒精性脂肪肝；大黃素；高脂血癥；代謝綜合征

非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)為目前臨床上最常見的慢性肝病之一。據研究[1]，它與高脂血癥、糖耐量異常、2型糖尿病、肥胖及高血壓病等代謝綜合征(Metabolic syndrome，MS)密切相關，而且當它合并MS或MS組分后嚴重心腦血管事件發生風險顯著增加，因此對NAFLD合并MS組分的防治具有非常重要的意義。本文通過高脂飼料喂養大鼠誘導非酒精性脂肪肝模型，進一步探討大黃素對非酒精性脂肪肝及其代謝合并癥的防治作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性SD大鼠42只，購自上海斯萊克景達實驗動物有限公司，清潔級，體重(140±10)g。

1.2 主要試劑、儀器與藥品膽固醇由北京鼎國生物技術有限公司提供(批號：94K102100)；丙基硫氧嘧啶片由上海朝暉藥業有限公司提供(批號：20081104)；豬膽酸納由北京市愛普華美生物科技有限公司提供(批號：20090312)；膽固醇、甘油三酯試劑盒購自浙江東甌津瑪生物科技有限公司(批號：2009070044、2009060036)；日立7600-020型全自動生化分析儀購自日本株式會社；大黃素由鄭州荔諾生物科技有限公司提供(批號：090316)，純度98%以上；二甲雙胍由北京中惠藥業有限公司提供(批號：20081217)。

1.3 動物造模、分組與給藥42只大鼠在清潔動物房內單籠飼養，其控制條件為室內溫度(20±2)℃，濕度(55±10)%，晝夜各12 h，自由飲水。適應性喂養1周后，42只大鼠按體重大小以隨機方法分為正常組組(A組、8只)和高脂組(M組、34只)，其中A組和M組分別給于普通飼料和高脂飼料(即參照文獻[2]稍加改進的高脂飼料配方：基礎飼料77.6%+豬油10%、蛋黃粉5%、蔗糖5%、膽固醇2%、膽鹽0.2%、丙硫氧嘧啶0.2%)喂養。第4周末隨機處死M組2只大鼠行肝臟HE染色病理學檢查，驗證有肝臟脂肪變后，A組(8只)大鼠予0.5%羧甲基纖維素鈉(SCMC)10 ml·kg-1·d-1灌胃。剩余的32只M組大鼠又按體重大小隨機分為四組(每組8只)：B組(B組)、低劑量大黃素組(C組)、高劑量大黃素組(D組)和E組(E組)，其中，B組予0.5%SCMC 10 ml·kg-1·d-1灌胃，C、D組分別予大黃素20 mg·kg-1·d-1和40 mg·kg-1·d-1灌胃，E組予二甲雙胍150 mg·kg-1·d-1灌胃，大黃素和二甲雙胍均以0.5% SCMC溶解；各大鼠喂養飼料及方式均不變。

1.4 標本采集與指標測定第8周末大鼠禁食12 h，行糖耐量試驗(OGTT)試驗(0 h、1 h、2 h)，稱體重，麻醉后下腔靜脈取血分離血清后用生化儀測定血谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)。取出肝臟，觀察肝臟外形，稱肝濕重，計算肝指數：(肝濕重/體重)×100%。取適量肝右葉組織制備以氯仿:甲醇(1:1)混合液為介質的10%肝組織勻漿，靜置、離心后取上清液檢測肝脂質TC、TG含量，按相應的試劑盒說明進行。取適量右肝組織，置于10%甲醛溶液中固定后常規HE染色，光鏡下肝臟脂肪變程度計分方案[3]：＜5%肝細胞脂肪變(0分)；5%～30%肝細胞脂肪變(1分)；31%～50%肝細胞脂肪變性(2分)；51%～75%肝細胞脂肪變(3分)；75%以上肝細胞脂肪變(4分)。肝臟炎癥程度計分參照慢性肝炎的炎癥計分方案[4]：計分指標共四項：匯管區炎癥(P)、小葉內炎癥(L)、碎屑壞死(PN)及橋接壞死(BN，包括多小葉壞死)；每項指標按病變程度分別計分為1、2、3、4分；由于PN、BN的嚴重程度與病變活動度和預后有直接關系，故在計分時加倍；肝臟炎癥程度計分公式為：P+L+2(PN+BN)。

1.5 統計學方法資料以均數±標準差(x-±s)表示，使用SPSS13.0統計軟件分析，如果資料為正態性、方差齊，則以方差分析及SNK檢驗，否則采用非參數檢驗。

2 結果

2.1 體重與肝指數各組間體重比較均無統計學意義(P＞0.05)。B組肝指數較A組升高(P＜0.01)；C、D組和E組肝指數均較B組降低(P＜0.01)，見表1。

2.2 血清ALT和AST與A組比較，B組大鼠血清ALT和AST升高(P＜0.01)；大黃素治療后血清ALT、AST較B組降低(P＜0.01)，其中大黃素降低ALT有劑量依賴關系(P＜0.05)；而E組血清ALT、AST較B組亦降低(P＜0.01，P＜0.05)，但D組較E組降低ALT、AST更明顯(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠體重、肝指數及血清轉氨酶的比較（

表1 各組大鼠體重、肝指數及血清轉氨酶的比較（

注：與A組比較，bP＜0.05，aP＜0.01；與B組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與C組比較，eP＜0.05；與E組比較，fP＜0.01。

A組B組C組D組E組77.24±11.07 143.96±25.83a98.06±22.06bd83.64±23.52df116.10±17.15ac283.11±14.30 298.45±17.63 290.56±13.18 287.68±15.45 288.30±16.09 3.60±0.34 5.07±0.19a4.71±0.20d4.56±0.30d4.48±0.17d38.61±9.56 105.26±17.72a72.83±13.08ad58.30±12.53adfe82.98±11.00ad

2.3 各組OGTT測定結果比較空腹血糖在各組之間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。各組大鼠予葡萄糖5 g/kg灌胃后1 h血糖有不同程度升高，其中，B組血糖較A組明顯升高(P＜0.01)；C、D組和E組血糖均較B組降低(P＜0.01)；于2 h時各組大鼠血糖不同程度恢復，其中，B組血糖仍較A組升高(P＜0.01)，C、D組和E組血糖較B組降低(P＜0.01)，見表2。

表2 各組大鼠OGTT結果(mmol/L，n=8)

表2 各組大鼠OGTT結果(mmol/L，n=8)

注：與A組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.01。

A組B組C組D組E組5.24±0.82 8.65±1.19a6.89±1.23ac7.00±0.74ac6.68±0.96ac4.20±0.65 4.54±0.61 4.40±0.59 4.29±0.60 4.10±0.61 7.13±0.75 10.14±1.63a8.39±1.12bc8.49±1.18bc8.53±0.95bc

2.4 各組血清TC、TG、LDL、HDL及肝脂質TC、TG含量比較B組大鼠血清TC、TG、LDL及肝TC和TG含量均較A組升高(P＜0.01)，而大鼠血清HDL較A組降低(P＜0.01)；C、D組血清TC、TG、LDL及肝TC和TG含量較B組均降低(P＜0.01)，以D組降低更明顯(P＜0.05)；E組血清LDL較B組降低(P＜0.01)，肝TC和TG含量較B組、C組降低(P＜0.01)；D組血清HDL較B組、C組升高(P＜0.01，P＜0.05)，見表3。

2.5 肝臟病理改變

2.5.1 大體病理改變A組肝臟形態大小正常，表面光滑細膩，邊緣銳利，色澤紅潤。B組肝臟形態飽滿，體積稍增大，表面粗糙有顆粒感，邊緣較鈍，色澤以土黃色為主。大黃素、二甲雙胍治療后肝臟表面、邊緣、色澤等大體病理改變較B組有不同程度改善。

2.5.2 光鏡下肝組織HE染色改變A組大鼠肝臟無脂肪變及炎癥改變。B組大部分肝細胞嚴重脂肪變性，肝竇受壓變小、甚至消失，以小葉周邊部更為明顯；肝小葉邊界不清，匯管區有不同程度炎癥形成。大黃素及二甲雙胍治療后肝臟脂肪變及炎癥程度較B組有好轉，其中，C、D組和E組肝臟脂肪變計分較B組有不同程度降低(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)，而且肝臟炎癥亦較B組有不同程度改善(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)。見表4。

表3 各組大鼠血清脂質及10%肝勻漿肝脂質含量測定結果(mmol/L，n=8)

表3 各組大鼠血清脂質及10%肝勻漿肝脂質含量測定結果(mmol/L，n=8)

注：與A組比較，aP＜0.01；與B組比較，bP＜0.01；與C組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與E組比較，eP＜0.01。

組別A組B組C組D組E組血清HDL 1.03±0.08 0.79±0.16a0.82±0.09 0.96±0.11bc0.88±0.12血清TC 1.74±0.39 10.78±1.28a6.63±1.38be5.13±1.25bce9.59±1.40血清TG 0.60±0.10 1.36±0.11a1.14±0.08be1.01±0.11bde1.29±0.07肝脂質TC 0.62±0.13 6.38±0.43a3.61±0.47be2.44±0.44bd2.18±0.31b肝脂質TG 1.29±0.19 4.78±0.57a3.28±0.48be2.17±0.54bd2.03±0.38b血清LDL 0.96±0.11 2.86±0.25a2.11±0.16be1.92±0.11bce2.47±0.21b

表4 各組大鼠肝臟組織脂肪變程度計分和炎癥活動度計分，n=8)

表4 各組大鼠肝臟組織脂肪變程度計分和炎癥活動度計分，n=8)

注：與A組比較，aP＜0.01；與B組比較，bP＜0.05cP＜0.01。

組別A組B組C組D組E組炎癥活動度計分0.00±0.00 3.13±0.99a1.88±0.83c1.50±0.76c2.13±0.83b脂肪變程度計分0.00±0.00 3.63±0.52a2.75±0.71b2.50±1.07c2.38±0.74c

3 討論

動物模型在研究NAFLD的發病機理及藥物評價方面有重要作用。本實驗以稍加改進的高脂飼料喂養SD大鼠后于第8周末B組肝臟呈中重度脂肪變，以重度為主，并伴一定炎癥，出現肝指數、轉氨酶及肝脂質含量增高，糖耐量異常，血脂異常等改變，證實成功復制了大鼠非酒精性脂肪肝模型并伴糖脂代謝紊亂。

據研究，NAFLD的治療意義不僅在于逆轉或減輕脂肪肝，阻止脂肪性肝炎的發生與進展，減少肝病殘疾和死亡；而且還重在控制代謝紊亂，減少MS相關組分或心腦血管事件發生的風險，而藥物無疑是NAFLD重要治療措施。大黃素是大黃等中藥的主要有效單體成分，化學名為1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌，用于防治脂肪肝及其代謝合并癥的報道較少見。本研究顯示大黃素治療后大鼠肝臟脂肪變及炎癥均有明顯好轉，進一步證實了大黃素防治NAFLD有效，此結果與文獻[5]的報道相近。本實驗顯示大黃素及二甲雙胍均可降低肝指數，提示此二藥均有減少肝臟脂肪含量和內臟性肥胖的作用，而這可提高胰島素敏感性，減少脂肪肝發生的一次打擊[6]。

本研究顯示高脂飼料喂養大鼠后出現了轉氨酶升高，提示高脂飲食可使脂肪肝大鼠產生肝細胞損傷及炎癥；而且有研究報道NAFLD伴轉氨酶升高使2型糖尿病和MS發生風險增加[7]。本實驗示大黃素治療后脂肪肝大鼠血清ALT、AST降低，說明大黃素具有修復肝細胞損傷及炎癥，改善肝功能的作用；其機制可能與大黃素改善脂肪肝大鼠腸道屏障功能、降低腸源性內毒素吸收、抑制炎癥等有關[8-9]。

本實驗顯示大黃素有降低餐后血糖、改善糖耐量的作用，其作用近似二甲雙胍，其機制可能與大黃素具有提高胰島素敏感性[10]有關，這有待進一步研究。

NAFLD與脂質代謝紊亂關系密切，而且有研究示NAFLD患者進食后形成的高脂血癥可能促使動脈粥樣硬化加快形成[11]，由此促進心腦血管疾病的發生。而大黃素具有降低大鼠血清TC、TG、LDL及肝TC、TG含量的作用，同時升高血HDL的作用，說明大黃素有改善脂質代謝紊亂的作用，但其具體機制有待研究。

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Effect of emodin on nonalcoholic fatty liver disease and its disturbance in the lipid and glucose metabolism in rat

ZHANG Ya-hui1,ZHOU Fu-xi2,LU Fang-gen2.Department of Gastroenterology，the Central Hospital of Yongzhou，Yongzhou 425000，Hunan,CHINA;2.Department of Gastroenterology,the Second Xiangya Haspital of Central South University,Changsha 410011,Hunan,CHINA

ObjectiveTo observe the effect of emodin on NAFLD and its disorder of glucose-lipid metabolism.MethodsSD rats were randomly divided into group A and M,which were separately fed with ordinary diets and high fat diets.Four weeks later,when hepatic steatosis were identified,group M were indvided randomly into group B,C,D and E.All feeding were unchanged.Group C,D and E were separately intervened with emodin by low doses,emodin by high doses and metformin.Four weeks later,the liver indexs and OGTT were observed.The serum transaminase,lipid and hepaticlipid were measured.The degree of steatosis and inflammation of liver were evaluated. ResultsThe liver indexs,the serum ALT and AST in group C and D were lower than those in group B(P＜0.01).The sugar tolerance in rats were improved(P＜0.01).The emodin reduced serum TC,TG,LDL and hepaticlipid(P＜0.01), increased serum HDL(P＜0.01),and the effect had a dose-dependent(P＜0.01).The steatosis and hepatic inflammatory activity were reduced(P＜0.05,P＜0.01).ConclusionThe emodin is effective to treat the NAFLD,and can correct its disorder of glucose-lipid metabolism.

Nonalcoholic fatty liver disease;Emodin;Hyperlipemia;Metabolic syndrome

R-332

A

1003—6350(2013)05—0636—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.05.0274

2012-09-20)

張亞輝。E-mail：2008zhangyahui@163.com