α-硫辛酸通過激活ERK1/2 減輕葡萄糖/葡萄糖氧化酶所致心肌細胞損傷

張陽陽 姚玉珍 李榮榮 劉莉

高血糖對心肌產生直接損傷，誘導凋亡，是糖尿病心肌損傷的獨立危險因素，其機制與產生過多的氧自由基有關［1］，但具體機制未完全明了。大量文獻顯示，心肌細胞凋亡是糖尿病心肌病發展過程中的關鍵分子事件［2］。因此，研究高濃度葡萄糖對心肌細胞損傷的機制，以期減少心肌凋亡，延緩糖尿病心肌病及心功能衰竭進程意義重大。

α-硫辛酸(α-lipoic acid，LA)是維生素B 族化合物，能清除自由基，具有抗氧化的作用［3］。臨床資料及動物實驗均證實，LA 可以安全有效地預防和治療多種疾病，如糖尿病周圍神經病變［4］、多發性硬化癥［5］、帕金森?。?，6］、腦梗死等［7］，其機制與凋亡信號通路ASK1/Daxx 抑制［4］、減輕線粒體老化有關［2］。

前期研究發現，LA 可顯著減輕高濃度葡萄糖/葡萄糖氧化酶(d-glucose/glucose oxidase，DG/GO)所致的心肌細胞損傷。本研究旨在探討LA 對DG/GO 所致心肌細胞損傷的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑LA、DG、GO 購自Sigma 公司。DMEM 細胞培養基及胎牛血清(fetal calf serum，FCS)購自Invitrogen Life Technology 公司。細胞培養板、培養皿購自Falcon 公司。

1.2 細胞培養 大鼠心肌細胞株H9c2 來自ATCC，由本實驗室保存。培養在含有10% FCS 的DMEM 培養基中。

1.3 ERK1/2 磷酸化水平測定 細胞分組如下:對照組:正常培養;LA 組:培養體系中含有300 μmol/L LA;DG/GO 組:培養體系中含有DG(30 mmol/L)及GO(5 mU/ml)。于LA 或DG/GO 作用3 h 后收集細胞，以Western blot 法檢測ERK1/2 磷酸化水平。具體方法為:提取胞漿蛋白，10%SDS-PAGE 電泳，封閉、轉膜，一抗4 ℃過夜，加入HRP 標記的二抗4 ℃孵育2 h。顯影劑顯色后，暗室曝光在X 光膠片上。ERK的活性測定以磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)與總ERK1/2 的比值表示。實驗進行3 次。

1.4 ERK 磷酸化抑制性實驗 細胞分組如下:對照組:正常培養;LA 組:培養體系中含有300 μmol/L LA;PD 組:加入ERK 磷酸化特異性抑制劑PD98059(30 μmol/L );PD + LA 組:加 入 PD98059(30 μmol/L)，30 min 后，再加LA。于LA 作用3 h，收集細胞，以Western blot 法檢測ERK 磷酸化水平。實驗進行4 次。

1.5 細胞存活檢測 細胞分組如下:對照組:正常培養;DG/GO 組:用DG(30 mmol/L)及GO(5 mU/ml)刺激細胞;LA +DG/GO 組:用LA(300 μmol/L)預處理細胞，12 h 后加入DG 及GO;PD+LA +DG/GO 組:加入PD98059(30 μmol/L)30 min，然后加入LA，其余同LA+DG/GO 組。

DG/GO 作用24 h 后，收集細胞，按課題組先前報道方法以四唑鹽比色法(MTT)測定細胞存活［8］。實驗進行5 次。

1.6 細胞凋亡檢測 實驗分組同“細胞存活檢測”。DG/GO 作用24 h 后，按課題組先前報道方法［8］，以Hoechst33342 熒光染色法分析細胞核固縮，以核固縮率作為細胞凋亡的指標。實驗進行4 次。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0 統計軟件處理，計量數據均數±標準差(ˉx ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LA 顯著激活ERK1/2 如圖1 所示，以DG/GO、LA 作用細胞3 h 后，與對照組比較，DG/GO 組和LA組的p-ERK1/2 水平均顯著升高(P ＜0.01)。然而，與DG/GO 組比較，LA 組的p-ERK1/2 水平顯著升高37.9%(P ＜0.01)。

圖1 LA 對ERK1/2 的激活作用

2.2 PD98059 阻斷LA 對ERK1/2 的激活作用 如圖2 所示，與LA 組比較，PD+LA 組的p-ERK1/2 水平下降了61.4%(P ＜0.01)。與對照組比較，PD +LA 組的p-ERK1/2 水平無顯著差異。

圖2 PD98059(PD)阻斷LA 對ERK1/2 的激活作用

2.3 PD98059 去除LA 對DG/GO 所致細胞存活率下降的保護作用 如圖3 所示，與對照組比較，DG/GO 使細胞存活率顯著下降了59.5%(P ＜0.01)。與DG/GO組比較，LA +DG/GO 組的存活率顯著提高了94.0%(P ＜0.01)。然而，與LA +DG/GO 組比較，PD +LA +DG/GO 組的存活率下降了72.8%(P ＜0.01)。與對照組比較，LA+DG/GO 組的存活率無顯著差異。

圖3 PD98059(PD)去除LA 對DG/GO所致細胞存活率下降的保護作用

2.4 PD98059 去除LA 對DG/GO 所致細胞凋亡的保護作用 如圖4 所示，與對照組比較，DG/GO 使細胞核固縮率增加了74.5 倍(P ＜0.01)。與DG/GO 組比較，LA+DG/GO 組的核固縮率顯著下降了90.8%(P ＜0.01)。然而，與LA +DG/GO 組比較，PD +LA +DG/GO 組的核固縮率增加了9.7 倍(P ＜0.01)。與DG/GO比較，PD+LA+DG/GO 組的核固縮率無顯著差異。

圖4 PD98059(PD)去除LA 對DG/GO所致細胞凋亡的保護作用

3 討論

長期處于高血糖環境中，易導致糖尿病患者心功能衰竭，糖尿病病情嚴重程度及心衰程度與血糖控制不佳密切相關［9］，大量體內及體外研究證實，高濃度葡萄糖可直接致心肌凋亡，機制與產生過量的氧自由基有關［1］，因此，很有必要探討高濃度葡萄糖致心肌損傷的機制。

糖尿病心肌病發生在糖尿病中，心肌細胞肥大，在晚期出現心肌間質及周圍血管纖維化，由于心肌細胞再生能力差，心肌細胞凋亡過多造成心功能失代償［1］。研究報道，高濃度葡萄糖致心肌細胞凋亡，機制涉及線粒體細胞色素c 釋放及caspase-3 活化及高糖誘導氧自由基增多有關［1］。

文獻報道，LA 是一種抗氧化劑，廣泛用來治療糖尿病及其并發癥。LA 通過清除自由基減輕糖尿病神經損傷［4］。LA 通過抗氧化應激對2 型糖尿病大鼠腎臟產生保護性作用［10］。Kowluru［11］報道長期注射LA延緩糖尿病視網膜病變進展，機制是通過抑制視網膜毛細血管細胞的凋亡。Palacka 等［12］發現使用LA 3月能顯著性改善糖尿病人心功能，這些數據表明，LA可能通過抗凋亡減輕糖尿病心肌損傷。

本實驗發現LA 對DG/GO 所致心肌細胞損傷有保護性作用，且LA 可激活H9c2 心肌細胞ERK1/2。以ERK1/2 選擇性抑制劑PD98059 阻斷LA 對ERK1/2 的激活作用后，可完全去除LA 對DG/GO 致心肌細胞損傷保護性作用。我們的結果顯示，LA 是通過激活ERK1/2 從而減輕DG/GO 所致的心肌損傷的。

ERK1/2 為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員，它能調控各種胞內反應包括新陳代謝、細胞分化、增殖，細胞的存活與凋亡［13］。Ottani 等［14］發現JNK/ERK/SATAT 通路介導，減輕黑質皮素對大鼠冠脈結扎心肌缺血再灌注損傷，減少心梗面積及心肌凋亡。有體外實驗報道，丹參酮減少缺氧條件下大鼠H9c2心肌細胞凋亡，該保護作用與ERK1/2 激活相關［15］。Han 等［16］在新生大鼠腦缺血損傷模型中發現腦源性神經生長因子(BDNF)能提高ERK1/2 的磷酸化水平，使用ERK1/2 抑制劑抑制ERK1/2 活性，能消除BDNF對腦缺血的保護作用。Tsao 等［17］報道色素上皮衍生因子(PEDF)激活ERK1/2，減輕H2O2誘導視網膜上皮細胞凋亡，使用ERK1/2 抑制劑PD98059 后，PEDF的保護作用顯著減弱。這些數據表明，ERK1/2 對細胞的保護作用可能與參與抗氧化應激來實現。

綜上，LA 對DG 引起的心肌細胞損傷有顯著保護作用，其機制是通過激活ERK1/2 介導的。除此之外，LA 對糖尿病周圍神經病變及糖尿病腎病的保護作用與減少氧自由基有關［4，10］。Wang 等［18］曾報道，LA 促進神經細胞突觸生長，機制與增加ERK1/2蛋白磷酸化水平有關，并短暫增加氧自由基含量。使用抗自由基制劑N-乙酰半胱胺酸后，ERK1/2 磷酸化水平下降，并且消除LA 促進神經細胞突觸生長。因此，LA 對DG引起的心肌細胞操作保護作用，還可能與氧自由基產生有關。由于適量服用LA 已經被證明對人體是安全的，例如有報道使用LA 治療2 型糖尿病患者能明顯改善糖尿病周圍神經病變［19］。因此，進一步探索LA對糖尿病心肌病的預防、治療作用，很有理論意義和實踐價值。

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