脂蛋白磷脂酶A2 基因V279F 和A379V 多態性與老年冠心病的關系

趙娜娜 洪梅 魯翔 嚴臘梅 周海波 賈志強

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病(coronary heart disease，CHD)，是目前嚴重危害老年人生命健康的最常見心血管疾病，研究證實炎癥在冠狀動脈硬化發生和發展過程中起著重要作用，多種炎癥因子被證實參與了動脈粥樣硬化的形成和發展［1-2］。脂蛋白磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)作為一種新型炎癥因子，與CHD 的發生密切相關。研究報道表明Lp-PLA2 的V279F、A379V、R92H和I198T 基因的多態性與CHD 的遺傳易感性具有相關性［3］，但是對于V279F 和A379V 基因多態性對CHD 的研究結論尚不一致，而且針對老年患者的研究較少見［4］，本文利用DNA 測序方法對中國老年漢族人群Lp-PLA2 基因多態性分布與CHD 遺傳易感性的相關性進行初步探討。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2011 年2 月至2012 年3 月期間在我院心內科住院的老年CHD 患者227 例，其中男119例，女108 例，年齡60 ～89 歲，平均(71.66 ±7.05)歲。對照組來源于本院健康體檢者101 例，其中男36例，女65 例，年齡60 ～88 歲，平均(66.94 ±6.57)歲。所有入組人員年齡≥60 歲，均行冠狀動脈造影檢查，CHD 的診斷符合WHO 的診斷標準。以左前降支、左回旋支和右冠狀動脈及其主要分支中至少有1 支冠狀動脈狹窄≥50%為有意義病變，或者患者有明確心肌梗死病史。所有患者均除外腫瘤、血液系統疾病、慢性肝腎功能不全等系統性疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 監測指標:記錄患者既往疾病史及吸煙史。空腹12 h 取靜脈血2 ml，用德國ROCHE 公司P800 全自動生化分析儀檢測三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等生物化學指標。

1.2.2 外周血白細胞DNA 的制備:取EDTA 抗凝的靜脈血200 μl，用美國Invitrogen 公司提供的基因組DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，TE 溶解保存于－20 ℃冰箱中。

1.2.3 Lp-PLA2 基因V279F 和A379V 位點的基因型檢測:Platinum?Taq DNA 聚合酶，定制引物均由美國Invitrogen 公司提供，V279F 引物序列包括上游引物:5'-TCCAGTGTGGGTGACTACAAA-3'，下游引物 5'-TATGGGGGCAAAAGAATAGC-3';A379V 引物序列包括上游引物:5'-TCAAGATACCAAGCAAGAACAAGA-3'，下游引物5'-GGATGTAAAGCAGCAAAATTGA-3'。待測樣品PCR 完畢，1.5% 的瓊脂糖膠鑒定，使用3730XL 型DNA 測序儀進行測序。

1.3 統計學處理 應用SPSS 16.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t 檢驗;計數資料以百分數表示，組間比較采用卡方檢驗。檢驗水準為α=0.05，P ＜0.05 表示差異具有統計學意義。采用SHEsis 軟件分析2 組的Hardy-Weinberg 平衡，組間基因型和等位基因頻率用Fisher's 精確概率檢驗。同時應用非條件logistic 逐步回歸模型分析CHD 主要危險因素，以比值比(OR)及其95%可信區間(95%CI)表示相對危險度。

2 結果

2.1 一般資料比較 CHD 組與對照組在高血壓、TG 水平等方面的比較無統計學差異，而CHD 組的年齡、吸煙比例和糖尿病比例明顯高于對照組(P ＜0.05)，血清TC、HDL-C 及LDL-C 水平則明顯低于對照組(P ＜0.05)。見表1。

表1 2 組基本資料比較

2.2 V279F 和A379V 基因型分布和等位基因頻率的比較 V279F 有VV 型、VF 型和FF 型3 種基因型，A379V 包括AA 型、AV 型和VV 型3 種基因型。CHD組與對照組之間V279F 和A379V 基因型的分布及等位基因頻率:V279F 和A379V 在CHD 組和對照組之間的分布符合Hardy-Weinberg 平衡(P ＞0.05)，V279F和A379V 基因型和等位基因的頻率在CHD 組和對照組之間分布差異均無統計學意義。CHD 組的亞組分析:V279F 和A379V 的基因型和等位基因的頻率在心肌梗死組和非心肌梗死組的分布無統計學差異。見表2，3。

表2 V279F 基因型的分布及等位基因頻率(n，%)

表3 A379V 基因型的分布及等位基因頻率(n，%)

2.3 單倍型分析 單倍型分析顯示FA、FV、VA、VV 4 種單倍型在CHD 組和對照組分布差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表4。

表4 V279F 和A379V 的單倍型分析

2.4 CHD 主要危險因素的logistic 回歸分析 以是否為CHD 作為因變量，年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病、TG、V279F、A379V 為自變量，進行logistic 回歸分析，在校正傳統風險因素后，未發現V279F 和A379V變異使患者患CHD 的風險增加。

3 討論

Lp-PLA2 又稱為血小板活化因子乙酰水解酶，是磷脂酶超家族中的一員，主要由單核巨噬細胞和淋巴細胞合成分泌，以多種亞型分布于細胞內和細胞外，Lp-PLA2 屬于非鈣離子依賴型，能夠催化甘油磷脂第2 位酰基酯鍵水解，在血液循環中主要與脂蛋白顆粒結合存在，絕大部分與低密度脂蛋白結合，少量與高密度脂蛋白及極低密度脂蛋白結合［5-6］。研究證實Lp-PLA2 的促動脈粥樣硬化的作用通過多種細胞途徑完成，與CHD 的發生發展密切相關，被認為是獨立于傳統心血管危險因素的獨立危險因子［7-8］。Guerra 等［9］研究表明LP-PLA2 活性62%受遺傳因素的影響，編碼Lp-PLA2 的基因位于第6 號染色體p21.2-p12，包含12個外顯子。在Lp-PLA2 基因多態性與CHD 相關性研究方面，日本研究者首先報道了9 號外顯子上V279F的變異對Lp-PLA2 活性的影響，該位點的錯義突變使纈氨酸變為苯丙氨酸，雜合突變可使酶活性下降，少數的純合突變甚至使酶失去活性，增加了日本人口心肌梗死和腦卒中的風險，可能是動脈粥樣硬化的遺傳因素之一［10］。Liu 等［11］對臺灣人群的研究發現V279F變異與CHD 心肌梗死的風險無明顯相關性，Hou等［12］對中國漢族人群的研究同樣未發現V279F 變異能夠增加CHD 的發病風險，而韓國的研究發現V279F變異可降低CHD 的發病風險［13］。隨后Li 等［14］的研究卻發現中國漢族人群的V279F 的突變與CHD 是具有相關性的，之后更多研究發現V279F 變異只存在于亞洲人種，并未在高加索人中發現，而且研究結果尚有矛盾，結論不一。此外，早期的Kruse 等［15］研究表明了11 號外顯子上A379V 的變異降低了Lp-PLA2 與底物親和力，在高加索人過敏癥和哮喘的發生中可能起著關鍵作用。而后Ninio 等［16］研究發現CHD 組A379V 的379V 等位基因的頻率明顯低于對照組，提出379V 等位基因攜帶者對心血管有保護作用，可能降低CHD 的發病風險。Li 等［14］的研究也同時指出該A379V 基因突變增加了心肌梗死的風險。杜克大學醫學中心研究［4］指出A379V 的突變，可導致Lp-PLA2與底物親和力的降低，與CHD 具有相關性。

本研究發現在漢族老年人口中，CHD 組V279F 和A379V 的基因型和等位基因頻率與對照組無明顯差異，心肌梗死組與非心肌梗死組間亦無統計學差異。進一步進行單體型分析未能發現與CHD 發病相關的單體型。在校正傳統危險因素后進行的logistic 回歸分析也未能發現與CHD 相關的基因型和等位基因。在本研究中出現了CHD 組的血清TC、HDL-C 以及LDL-C 水平明顯低于對照組的情況，考慮由于絕大多數CHD 患者在入院前已經服用調脂藥物治療，導致血脂水平降低。由于本研究總體樣本量較少，在進行入組篩選時將左前降支、左回旋支和右冠狀動脈及其主要分支中至少有一支冠狀動脈狹窄≥50%納入CHD組，而對照組中尚存在一部分有冠脈粥樣硬化病變的患者，從而可能輕度導致V279F 和A379V 的基因型和等位基因頻率與CHD 組無明顯差異，在加大樣本量以及分組標準更加細致化的時候可能會避免上述問題，使最后結果更有意義。

總之，對中國老年漢族人群的Lp-PLA2 基因多態性的研究，與國內的一些研究結果基本一致，但由于實驗條件所限未能定量定性檢測Lp-PLA2 的活性，未能更加明了直觀地分析V279F 和A379V 多態性與Lp-PLA2 活性的關系。隨著Lp-PLA2 基因多態性研究的不斷完善和深入，Lp-PLA2 多態性位點的檢測與老年CHD 的關系將會更加明確。

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