補(bǔ)腎陽復(fù)方激活腎上腺皮質(zhì)類固醇合成酶的研究

曾洋 黃建華 孫偉 馬方勵(lì) 夏世金

腎陽又被稱為元陽，在機(jī)體功能調(diào)節(jié)中占有重要的地位。腎陽虛證是指由于腎陽虛衰、溫煦失職、氣化失權(quán)所表現(xiàn)的一類虛寒證候。腎陽虛的現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)腎陽虛患者特異性具有腎上腺皮質(zhì)功能或儲(chǔ)備功能低下，補(bǔ)腎陽藥可對(duì)腎陽虛患者下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，我們以往的研究以及其他報(bào)道顯示補(bǔ)腎陽升高血漿皮質(zhì)酮水平［1-3］，為深入研究其機(jī)制，本研究組首先采用基因芯片在全基因組范圍內(nèi)篩選補(bǔ)腎陽藥物作用后的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎陽藥能提高多個(gè)類固醇合成酶的mRNA 表達(dá)，對(duì)此進(jìn)一步用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 自擬補(bǔ)腎陽復(fù)方(由巴戟天、枸杞、桂枝組成)粉末由無限極中國有限公司提供，組成比例為5 ∶4 ∶1。皮質(zhì)酮購自Sigma 公司;類固醇合成酶免試劑盒購自Caymen 公司。

1.2 動(dòng)物分組及一般處理 30 只雄性SD 大鼠，體質(zhì)量(200 ±6)g，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、自擬補(bǔ)腎陽復(fù)方組(復(fù)方組)，每組10 只。動(dòng)物先適應(yīng)喂養(yǎng)5 d，模型組、復(fù)方組第6 天開始給予10 mg/kg 皮下注射皮質(zhì)酮，對(duì)照組以等體積滅菌橄欖油代替皮質(zhì)酮注射。另外復(fù)方組將自擬補(bǔ)腎陽復(fù)方粉末混懸于生理鹽水，并按292 mg/(kg·d)灌胃;對(duì)照組和模型組等體積生理鹽水灌胃。

1.3 血漿皮質(zhì)酮和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)濃度檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取血漿，采用ELISA 方法檢測(cè)，具體方法按Caymen 公司試劑盒說明。取樣品10 μl，加40 μl 緩沖液(稀釋5 倍)，除空白孔，每孔加入50 μl Tracer 和50 μl 一抗。室溫(23 ℃)，在搖床上孵育2 h，孵育完畢洗板5 次。每孔加入200 μl Ellman＇s Reagent，避光，在搖床上孵育75 min，孵育完畢，用酶標(biāo)儀在412 nm 波長，讀取OD 值，計(jì)算濃度。

1.4 基因芯片檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取腎上腺，提取總RNA，NanoDrop ND-1000 測(cè)定濃度，標(biāo)準(zhǔn)變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性。每個(gè)樣本取5 μg 總RNA 用于標(biāo)記和微陣列雜交。用Invitrogen Superscript ds-cDNA synthesis kit 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用NimbleGen one-color DNA labeling kit 進(jìn)行ds-cDNA 標(biāo)記。用NimbleGen hybridization system 進(jìn)行微陣列雜交，用NimbleGen wash buffer kit 進(jìn)行洗滌。用Axon GenePix 4000B microarray 掃描儀(Molecular Devices Corporation)進(jìn)行陣列掃描。掃描圖像(TIFF 格式)導(dǎo)入到NimbleScan 軟件(2.5 版)進(jìn)行柵格匹配和數(shù)據(jù)分析。原始數(shù)據(jù)采用百分位數(shù)法進(jìn)行歸一化，并形成探針?biāo)叫盘?hào)強(qiáng)度和基因水平信號(hào)強(qiáng)度。基因水平信號(hào)強(qiáng)度導(dǎo)入Agilent GeneSpring GX 軟件(11.5.1 版)進(jìn)行進(jìn)一步分析。差異表達(dá)基因經(jīng)t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 篩選。信號(hào)通路、gene ontology 分析采用DAVID 在線程序。1.5 蛋白印跡 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取腎上腺，稱重，計(jì)算腎上腺質(zhì)量指數(shù)(腎上腺質(zhì)量/體質(zhì)量)。然后稱取20 mg，加入細(xì)胞裂解液100 μl(含PMSF 1 mmol/L)，勻漿，冰上靜置5 min，1300 r/min 離心5 min，取上清，采用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。按試劑盒說明書配制12%SDS-PAGE 分離膠，配5%濃縮膠，每孔加樣總蛋白量為35 μg，70 V 恒壓電泳2 h，11 V 恒壓轉(zhuǎn)膜過夜，取出印記膜，室溫封閉1 h，用一抗稀釋液按1 ∶200 稀釋一抗，室溫孵育1 h，二抗稀釋液按1 ∶5000 稀釋二抗，室溫孵育1 h 后，洗滌，按說明書加入ECL 化學(xué)發(fā)光液，室溫孵育3 min，去除過量的溶液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X 光膠片曝光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 除基因表達(dá)數(shù)據(jù)，其他數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 15.0 for windows 軟件包對(duì)樣本進(jìn)行單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠體質(zhì)量變化比較 在造模前，各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);在造模第7 天時(shí)，模型組大鼠體質(zhì)量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。復(fù)方組體質(zhì)量與模型組比較明顯升高(P ＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與對(duì)照組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。造模第14 天時(shí)，模型組和復(fù)方組體質(zhì)量與對(duì)照組比較顯著降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)，復(fù)方組與模型組比較，則顯著升高(P ＜0.05)。見表1。

表1 3 組大鼠體質(zhì)量變化比較(±s，g，n=10)

表1 3 組大鼠體質(zhì)量變化比較(±s，g，n=10)

注:與對(duì)照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別造模前造模第7 天造模第14天203.50 ±3.34305.75 ±7.21337.75 ±6.54模型組200.25 ±3.28266.00 ±10.80＊＊303.50 ±14.13＊＊復(fù)方組199.45 ±3.52295.50 ±8.35△△320.00 ±10.15對(duì)照組＊△

2.2 3 組大鼠腎上腺質(zhì)量及腎上腺質(zhì)量指數(shù)比較模型組及復(fù)方組大鼠腎上腺質(zhì)量較對(duì)照組明顯下降(P＜0.01)，復(fù)方組較模型組明顯升高(P ＜0.05)。3 組間大鼠腎上腺質(zhì)量指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表2。

2.3 3 組大鼠血漿皮質(zhì)酮、ACTH 水平的比較 與對(duì)照組比較，模型組血漿皮質(zhì)酮和ACTH 顯著降低(P ＜0.01)。與模型組比較，復(fù)方組血漿皮質(zhì)酮和ACTH含量顯著升高(P ＜0.05)。見表2。

表2 3 組大鼠腎上腺質(zhì)量及指數(shù)、血漿皮質(zhì)酮及ACTH 濃度變化比較(±s，n=10)

表2 3 組大鼠腎上腺質(zhì)量及指數(shù)、血漿皮質(zhì)酮及ACTH 濃度變化比較(±s，n=10)

注:與對(duì)照組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05

組別腎上腺質(zhì)量(mg)腎上腺質(zhì)量指數(shù)血漿皮質(zhì)酮濃度(ng/ml)ACTH(ng/ml)對(duì)照組49.63 ±6.000.15 ±0.0216.22 ±5.37324.46 ±132.92模型組28.88 ±9.45＊＊0.10 ±0.035.50 ±4.25＊＊150.25 ±60.54＊＊復(fù)方組35.57 ±7.53＊＊△0.11 ±0.0211.40 ±6.34△330.57 ±224.05△

2.4 基因芯片結(jié)果

2.4.1 差異基因情況:所有差異表達(dá)基因均為差異調(diào)節(jié)2 倍以上，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。模型組與對(duì)照組比較，1098 個(gè)基因上調(diào);補(bǔ)腎復(fù)方作用后，共有1135 個(gè)基因下調(diào)，其中模型組上調(diào)的基因表達(dá)被逆轉(zhuǎn)的有735 個(gè)。模型組與對(duì)照組比較，603 個(gè)基因下調(diào);補(bǔ)腎復(fù)方作用之后，共有477 個(gè)基因上調(diào)，其中模型組下調(diào)的基因表達(dá)被逆轉(zhuǎn)的有93 個(gè)。這些基因組間的基因表達(dá)模式被明顯逆轉(zhuǎn)。

2.4.2 被補(bǔ)腎復(fù)方逆轉(zhuǎn)的基因信號(hào)通路分析:為進(jìn)一步探索保護(hù)HPA 軸的功能，我們對(duì)被補(bǔ)腎陽復(fù)方逆轉(zhuǎn)的828 個(gè)基因進(jìn)行了信號(hào)通路分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在被補(bǔ)腎復(fù)方調(diào)節(jié)的基因富集的信號(hào)通路中，有2 個(gè)引起了我們的重視:MAPK 信號(hào)通路和類固醇合成通路。見表3。

表3 補(bǔ)腎復(fù)方逆轉(zhuǎn)的基因富集的信號(hào)通路

2.5 補(bǔ)腎陽復(fù)方提高類固醇合成酶蛋白表達(dá) 各組動(dòng)物HSD11B1、CYP7A1 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示，模型組這2 種蛋白表達(dá)降低，而自擬補(bǔ)腎陽復(fù)方作用后，HSD11B1 的表達(dá)水平明顯升高，但對(duì)CYP7A1 表達(dá)的上調(diào)作用不明顯。見圖1。

3 討論

大劑量糖皮質(zhì)激素長期應(yīng)用對(duì)機(jī)體多方面產(chǎn)生藥理效應(yīng)，如激活肝臟糖原分解酶使糖原分解加速，血糖升高;激活脂肪分解酶使脂肪分解加速，血脂升高;與淋巴細(xì)胞中糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合，發(fā)揮抗炎癥的效應(yīng)，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡［4-5］。超過一定量的血漿糖皮質(zhì)激素水平也通過負(fù)反饋抑制下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)分泌，進(jìn)而抑制垂體ACTH 分泌，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)腎上腺自身分泌糖皮質(zhì)激素長期減少，并且長期大劑量糖皮質(zhì)激素的反饋抑制使HPA 軸發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，如下丘腦CRH 神經(jīng)元減少，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞凋亡及腎上腺萎縮［6-7］，高水平的糖皮質(zhì)激素還會(huì)引起免疫系統(tǒng)的抑制和胸腺淋巴細(xì)胞凋亡［8］。

圖1 補(bǔ)腎陽復(fù)方對(duì)有關(guān)類固醇合成酶表達(dá)的作用

國際上已有研究探索如何促進(jìn)HPA 軸恢復(fù)，但仍未取得成功。Markowska 等［9］報(bào)道一個(gè)十肽Pneumadin(PNM)，通過促進(jìn)精氨酸加壓素(AVP)和ACTH 的釋放，防止腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和體積的減少，可增加腎上腺組織皮質(zhì)酮和醛固酮的含量，但不能引起2 種激素血漿水平的變化。Maces 等［10］在應(yīng)用地塞米松后的抑郁患者中發(fā)現(xiàn)5-羥色胺1A 受體興奮劑丁螺旋酮能升高血漿ACTH 和可的松濃度，并提出丁螺旋酮通過促進(jìn)ACTH 合成和釋放使應(yīng)用地塞米松后的抑郁患者免于HPA 抑制，但作為抗抑郁藥，丁螺旋酮能否用于其他HPA 軸受抑情況還沒有相關(guān)報(bào)道。本研究中，我們觀察到補(bǔ)腎陽復(fù)方能升高模型鼠腎上腺質(zhì)量、升高血漿皮質(zhì)酮的水平，提示具有提高HPA 軸功能的作用。

本研究我們采用基因表達(dá)譜對(duì)補(bǔ)腎陽復(fù)方保護(hù)腎上腺皮質(zhì)功能的機(jī)制進(jìn)行了初步探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在皮質(zhì)酮造成的基因表達(dá)改變中，補(bǔ)腎復(fù)方逆轉(zhuǎn)了828 個(gè)，包括在模型組上調(diào)，后被補(bǔ)腎陽復(fù)方下調(diào)的;也包括在模型組下調(diào)，后被補(bǔ)腎陽不放上調(diào)的。我們認(rèn)為這些基因可能是補(bǔ)腎陽復(fù)方發(fā)揮作用的候選基因。信號(hào)通路分析結(jié)果有2 條通路引起了重視，一是MAPK 信號(hào)通路，有11 個(gè)基因?qū)儆谠撏罚貏e是其中的FGFs，研究表明對(duì)腎上腺皮質(zhì)的再生起著關(guān)鍵作用［11］，該通路上調(diào)為實(shí)驗(yàn)中觀察到補(bǔ)腎陽復(fù)方能提高腎上腺質(zhì)量的結(jié)果可能提供了一種解釋。另外一條通路是類固醇合成通路，共有6 個(gè)基因被上調(diào)，均是皮質(zhì)酮生物合成中的各種酶，因此我們進(jìn)一步采用western blot 檢測(cè)HSD11B1、CYP7A1 蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎陽復(fù)方對(duì)HSD11B1 蛋白表達(dá)確有提高作用，這一結(jié)果為補(bǔ)腎陽復(fù)方升高血漿皮質(zhì)酮水平提供了部分解釋。

在實(shí)驗(yàn)中，我們還觀察到補(bǔ)腎陽復(fù)方對(duì)動(dòng)物體質(zhì)量均有明顯的保護(hù)作用。在造模第7 天時(shí)，造模組大鼠體質(zhì)量與對(duì)照組比較顯著下降，而補(bǔ)腎陽藥物治療組體質(zhì)量與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表現(xiàn)了對(duì)皮質(zhì)酮大鼠體質(zhì)量具完全保護(hù)作用。造模第14天，我們也發(fā)現(xiàn)對(duì)大鼠體質(zhì)量具有保護(hù)作用，這些在器官水平的結(jié)果提示補(bǔ)腎陽藥物不僅對(duì)HPA 軸，而且對(duì)糖皮質(zhì)激素造成的過度分解代謝狀態(tài)具有保護(hù)作用。關(guān)于拮抗糖皮質(zhì)激素促分解代謝的不良反應(yīng)，國外有一些研究報(bào)道［12-13］，補(bǔ)腎陽中藥在這些方面表現(xiàn)了顯著效果，其具體機(jī)制值得深入研究。

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