誘導(dǎo)型一氧化氮合酶對二甲氧乙二酰甘氨酸預(yù)處理晚期腎保護作用的影響

陸文俊 張曉麗 葉志斌 夏世金

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是一種常見的臨床危急重癥，普通住院患者發(fā)病率為2% ～7%，重癥監(jiān)護室中的發(fā)病率則高達10% ～30%。雖然臨床上針對AKI 采取了一系列的防治措施，但該病的病死率仍高達30% ～80%。腎缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是AKI 的最常見病因，至今缺乏有效防治手段［1］。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia induced factor 1α，HIF-1α)是調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的核心調(diào)控因子［2-3］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylases domain-containing protein，PHD)抑制劑二甲氧乙二酰甘氨酸(dimethyloxallyl glycine，DMOG)預(yù)處理可穩(wěn)定腎小管上皮細(xì)胞HIF-1α 表達，減輕腎IRI［4-5］，但關(guān)于其晚期腎保護作用及其機制研究尚未見報道。本研究旨在證實DMOG 預(yù)處理對小鼠腎IRI 的晚期保護作用，并利用誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric-oxide synthase，iNOS)特異性抑制劑干預(yù)的方法探討iNOS 在此過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 雄性C57BL/6N 小鼠24 只，體質(zhì)量22 ～26 g(SPF 級，中科院上海實驗動物中心)，隨機分為4 組:假手術(shù)(sham)組、IRI 組、DMOG 預(yù)處理組(DMOG + IRI)和GW274150 干預(yù)組(GW274150+DMOG+IRI)，每組各6 只。

1.2 模型制作 2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，取腹正中切口，鈍性分離腎蒂，無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂造成腎缺血，持續(xù)夾閉30 min 后松開動脈夾，恢復(fù)血流，觀察1 min，腎臟由暗紫色逐漸轉(zhuǎn)為鮮紅色，表明再灌注成功，縫合傷口。sham 組只分離腎蒂，然后關(guān)腹;DMOG 預(yù)處理組在缺血術(shù)前24 h 腹腔注射DMOG (40 mg/kg，Cayman 公司，美國);GW274150 干預(yù)組在DMOG 預(yù)處理后的術(shù)前30 min予腹腔注射iNOS 特異性抑制劑GW274150(10 mg/kg，Enzo Life Sciences，美國)。缺血再灌注24 h 后，采血并處死小鼠，留取腎組織備用。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 腎功能檢測:眶下靜脈叢采血，分離血清，酶法測定小鼠血清肌酐(SCr)濃度(日立全自動生化分析儀)。

1.3.2 腎組織病理學(xué)檢查:10%中性甲醛固定腎組織，制作石蠟切片，常規(guī)HE 染色，顯微鏡下觀察腎臟病理改變。根據(jù)腎小管細(xì)胞扁平、管腔擴張、細(xì)胞脫落壞死、腎小管管型堵塞、間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤及出血等觀察腎小管間質(zhì)損傷情況。

1.3.3 Western blot 檢測:分別提取組織核蛋白和總蛋白，BCA 法測定組織蛋白濃度。行PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，鼠抗HIF-1α 單克隆抗體(Novus Biologicals 公司，美國)或兔抗iNOS 多克隆抗體(Cell Signaling Technology 公司，美國)或兔抗Actin 多克隆抗體(Sigma-Aldrich，美國)4 ℃孵育過夜，TPST 洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔lgG(Jackson公司，美國)37 ℃孵育1 h，曝光、顯影、成像。應(yīng)用圖像分析軟件對HIF-1α 和iNOS 特異性條帶進行吸光度分析。

1.3.4 細(xì)胞凋亡的檢測:采用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(Tunel 法)，按試劑盒(Roche公司，德國)說明書進行操作。每一切片選取10 個視野，在200 倍光鏡下，盲法觀察染色陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腎功能測定 與sham 組相比，IRI 組小鼠SCr 明顯升高;DMOG 預(yù)處理可降低IRI 小鼠的SCr 水平;然而，如果在IRI 前事先應(yīng)用iNOS 特異性抑制劑GW274150 可使DMOG 預(yù)處理小鼠SCr 升高。見表1。

2.2 各組小鼠腎臟病理學(xué)改變 HE 染色結(jié)果顯示，IRI 組小鼠腎組織病理學(xué)改變明顯，受損部位集中在外髓內(nèi)帶的近端小管，主要表現(xiàn)為刷狀緣脫落，腎小管細(xì)胞扁平、脫落，管腔擴張，腎小管管腔內(nèi)被管型堵塞，間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤和出血;DMOG 預(yù)處理組腎組織病理學(xué)改變較IRI 組顯著改善;iNOS 特異性抑制劑GW274150 干預(yù)則使DMOG 預(yù)處理小鼠腎組織損傷加重。見圖1。

圖1 4 組小鼠腎組織病理光鏡下改變(HE，×200)

2.3 各組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡的檢測 結(jié)合蘇木素染色結(jié)果顯示，sham 組小鼠腎組織腎組織中僅見少量腎小管上皮細(xì)胞凋亡;IRI 組小鼠腎小管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的凋亡跡象，凋亡細(xì)胞主要集中在皮髓交界、髓質(zhì)，DMOG 預(yù)處理組腎組織細(xì)胞凋亡數(shù)目較IRI 組明顯減少;iNOS 特異性抑制劑GW274150 干預(yù)可使DMOG 預(yù)處理小鼠腎組織細(xì)胞凋亡數(shù)目增加。見圖2及表1。

圖2 各組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況(×200)

2.4 DMOG 預(yù)處理24 h 后小鼠腎組織中的HIF-1α蛋白的表達 小鼠予腹腔注射40 mg/kg 的DMOG 進行預(yù)處理，24 h 后小鼠腎組織中HIF-1α 蛋白表達較注射磷酸鹽緩沖液的對照小鼠明顯增加［(2.36 ±0.25)%比(0.57 ±0.06)%，P ＜0.05］。見圖3。

圖3 HIF-1α Western blot 檢測結(jié)果

2.5 4 組小鼠腎組織中iNOS 蛋白的表達 sham 組幾乎沒有iNOS 表達，IRI 組iNOS 表達增加，DMOG 預(yù)處理后iNOS 進一步增加，DMOG 預(yù)處理前予iNOS 特異性抑制劑GW274150 可減弱iNOS 的表達。見圖4及表1。

圖4 iNOS Western blot 檢測結(jié)果

表1 各組小鼠SCr 水平、腎組織細(xì)胞凋亡水平及iNOS 蛋白的表達(±s，n=6)

表1 各組小鼠SCr 水平、腎組織細(xì)胞凋亡水平及iNOS 蛋白的表達(±s，n=6)

注:與sham 組比較，△P ＜0.05;與IRI 組比較，* P ＜0.05;與GW274150干預(yù)組比較，#P ＜0.05

組別SCr(μmol/L) 細(xì)胞凋亡(%)iNOS/Actin sham 組9.8 ±2.22.6 ±1.30.21 ±0.03 IRI 組238.7 ±32.5△ 26.0 ±3.6△ 0.78 ±0.16△DMOG 預(yù)處理組12.3 ±3.6* #8.2 ±1.5* # 1.62 ±0.25* #GW274150 干預(yù)組162.2 ±31.417.3 ±2.51.09 ±0.18

3 討論

過去的20 年中，人們對細(xì)胞缺血缺氧環(huán)境下的適應(yīng)性反應(yīng)進行了不少研究，但其機制仍未完全闡明。HIF-1 是哺乳動物細(xì)胞低氧應(yīng)答的核心調(diào)節(jié)因子，由α亞基和β 亞基組成，其中α 亞基是低氧調(diào)控的功能性亞基。常氧條件下，HIF-1 極不穩(wěn)定，通過脯氨酸羥化酶羥基化啟動泛素-蛋白酶體途徑迅速發(fā)生降解;缺氧條件下，脯氨酸羥化酶功能喪失，阻斷了HIF-1α 羥基化降解，積聚的HIF-1α 轉(zhuǎn)位入核，與HIF-1β 結(jié)合，啟動一系列下游功能基因的轉(zhuǎn)錄表達，以適應(yīng)低氧環(huán)境。截止目前，已發(fā)現(xiàn)受其調(diào)控的靶基因多達百余種，它們在血管新生、糖代謝及細(xì)胞生存、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮極其重要的作用［6-7］。我們前期研究證實，通過預(yù)處理穩(wěn)定腎小管上皮細(xì)胞HIF-1α 的表達，可以模擬缺血預(yù)適應(yīng)，增強腎小管上皮細(xì)胞對IRI 的耐受，減輕腎小管上皮凋亡，其機制可能與HIF-1α 激活后促進了一系列保護基因如血紅素氧合酶-1(heme oxygenase，HO-1)、促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)和熱休克蛋白70(heat shock protein，HSP70)的轉(zhuǎn)錄表達有關(guān)［4-5］。

缺血預(yù)適應(yīng)的保護作用具有雙時相性，根據(jù)時間早晚分為早期缺血預(yù)適應(yīng)和晚期缺血預(yù)適應(yīng)。早期缺血預(yù)適應(yīng)在預(yù)缺血幾分后即可出現(xiàn)，一般持續(xù)2 ～4 h;晚期缺血預(yù)適應(yīng)在缺血預(yù)處理12 ～24 h 后出現(xiàn)，能持續(xù)幾天甚至數(shù)周［8］;同樣，藥物預(yù)處理也存在這種晚期腎保護作用，但關(guān)于DMOG 晚期腎保護作用及其機制研究尚未見報道。本實驗表明，DMOG 通過改善IRI小鼠的腎功能，減輕腎組織病理學(xué)損傷，減少腎組織細(xì)胞凋亡，對小鼠腎IRI 產(chǎn)生晚期保護作用。

機體中存在3 種一氧化氮合酶:內(nèi)皮型(endothelial NOS，eNOS)、神經(jīng)型(neuronal NOS，nNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)。iNOS 刺激后釋放一氧化氮(NO)較慢，持續(xù)時間長，既往研究證實，iNOS 是晚期預(yù)適應(yīng)的觸發(fā)和調(diào)節(jié)因子，它參與了缺血預(yù)處理及多種藥物預(yù)處理的晚期心、腎保護作用［8-10］。GW274150 是一種特異性iNOS 抑制劑，對于其他2 種一氧化氮合酶幾乎沒有作用。本實驗中通過Western blot 方法檢測了iNOS 在各組小鼠腎組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IRI 組存在一定程度的iNOS 表達，DMOG 預(yù)處理后iNOS 增加更加明顯，而DMOG 預(yù)處理后予GW274150 可明顯減弱小鼠IRI 腎組織中iNOS 的表達。由此說明，iNOS 特異性抑制劑GW274150 可大大削弱脯氨酸羥化酶抑制劑DMOG 對小鼠IRI 的晚期保護作用。

iNOS 主要通過合成NO 來發(fā)揮作用。NO 可以激活鳥苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生環(huán)鳥苷酸(cGMP)，進而激活蛋白激酶G 并通過開放線粒體鉀通道而產(chǎn)生腎保護作用［8］。值得指出的是，低水平的NO 對腎臟具有保護作用，而過高水平的NO 將對腎臟具有損傷作用，我們推測DMOG 預(yù)處理恰恰是產(chǎn)生了中等程度的iNOS/NO，進而啟動保護性信號途徑對抗之后的腎IRI。另外，有報道，常氧條件下，NO 供體可刺激HIF-1α 表達［11］。因此，我們推測DMOG 預(yù)處理可穩(wěn)定HIF-1α，促進HIF-1α 靶基因iNOS 表達，使NO 合成增多，進而通過陽性反饋作用進一步觸發(fā)HIF-1α 活化，放大其腎保護作用。

總之，本研究提示了DMOG 預(yù)處理對小鼠IRI 腎臟產(chǎn)生晚期保護作用，iNOS 特異性抑制劑可削弱這種保護性作用，這意味著iNOS 參與了HIF-1α 活化引發(fā)的腎保護作用。

［1］ Thadhani R，Pascual M，Bonventre JV. Acute renal failure［J］. N Engl J Med，1996，334(22):1448-1460.

［2］ Haase VH. Hypoxia-inducible factors in the kidney［J］. Am J Physiol Renal Physiol，2006，291(2):F271-F281.

［3］ Myllyharju J. HIF prolyl 4-hydroxylases and their potential as drug targets［J］. Curr Pharm Des，2009，15 (33):3878-3885.

［4］ 張曉麗，劉紅，鄒建洲，等.二甲氧乙二酰甘氨酸對小鼠腎缺血/再灌注損傷的保護作用［J］. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2008，17(4):26-29.

［5］ 張曉麗，盛蔚文，陳偉軍，等.二甲基乙二酰基甘氨酸對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的保護作用及其機制［J］.中華腎臟病雜志，2010，26(3):210-214.

［6］ Matsumoto M，Makino Y，Tanaka T，et al. Induction of renoprotective gene expression by cobalt ameliorates ischemic injury of the kidney in rats［J］. J Am Soc Nephrol，2003，14(7):1825-1832.

［7］ Jaakkola P，Mole DR，Tian YM，et al. Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation［J］. Science，2001，292(5516):468-472.

［8］ Park KM，Byun JY，Kramers C，et al. Inducible nitric-oxide synthase is an important contributor to prolonged protective effects of ischemic preconditioning in the mouse kidney［J］. J Biol Chem，2003，278(29):27256-27266.

［9］ Wakeno-Takahashi M，Otani H，Nakao S，et al. Isoflurane induces second window of preconditioning through upregulation of inducible nitric oxide synthase in rat heart［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289(6):H2585-H2591.

［10］Zhao T，Xi L，Chelliah J，et al. Inducible nitric oxide synthase mediates delayed myocardial protection induced by activation of adenosine A(1)receptors:evidence from geneknockout mice［J］. Circulation，2000，102(8):902-907.

［11］Kimura H，Weisz A，Kurashima Y，et al. Hypoxia response element of the human vascular endothelial growth factor gene mediates transcriptional regulation by nitric oxide:control of hypoxia-inducible factor-1 activity by nitric oxide［J］.Blood，2000，95(1):189-197.