直腸癌凋亡相關蛋白與腫瘤細胞體外化療藥物敏感性的關系

張海峰，李金海，戴華衛，周瑞耀

（溫州醫學院附屬第三醫院 普通外科，浙江 溫州 325200）

多重耐藥性的存在，常導致直腸癌術后化療失敗[1]。通過研究不同細胞株已經證實，多藥耐藥（MDR）的重要機制之一就是腫瘤細胞對化療藥物產生凋亡抵抗[2-3]。因此，克服腫瘤細胞耐藥性，提高抗癌藥物療效已成為腫瘤治療中亟待解決的關鍵性問題。本研究旨在檢測直腸癌組織Survivin、bcl-2及bax的表達，并探討其與體外腫瘤細胞化療藥物敏感性的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 2008年1月至2012年1月間在溫州醫學院附屬第三醫院手術且經病理證實的48例直腸癌患者新鮮腫瘤組織標本。其中男27例，女21例，年齡（63.12±13.11）歲。術前均未接受任何治療。術中分別取新鮮腫瘤組織1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm置入雙抗培養液行噻唑藍（MTT）法體外腫瘤細胞化療藥物敏感實驗。另每例腫瘤標本經中性甲醛溶液固定，常規石蠟包埋、切片，行免疫組織化學染色。

1.2 免疫組織化學染色測定凋亡相關蛋白Survivin、bcl-2、bax蛋白表達 鼠抗人Survivin、bcl-2、bax多克隆抗體、免疫組織化學試劑盒購自美國eBioscience公司，鏈霉卵白素-生物素-辣根過氧化物酶復合物（SP）法對腫瘤組織進行上述指標染色，并嚴格按試劑盒說明書進行。磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗做陰性對照，已知陽性切片作陽性對照。由兩位高年資病理醫師分別雙盲閱片進行結果判讀。每張切片隨機取5個高倍（×400）視野，每視野計數100個細胞，Survivin、bcl-2、bax以細胞膜及（或）細胞質呈黃色為染色陽性，按著色強度和陽性細胞率分別進行記分。著色強度記分：無著色0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分。陽性細胞率記分標準：陽性細胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；兩種記分標準所得分值的乘積為0～1分陰性（-），2～3分弱陽性（+），4～7分陽性（++），≥8分強陽性（+++）。表達強度標準：記分≤3分為弱表達，≥4分為強表達。

1.3 體外藥物敏感實驗 MTT（Bio Vision公司），DMEM培養基及胰蛋白酶（Pepro Tech公司）。酶標儀DNM-9602A（北京普朗公司），直腸癌組織研磨分散，用細胞分離器調整濃度為5×108/L。使用前將腫瘤藥敏檢測板和培養基預溫至37.0 ℃。9種受試藥物分別為：氟尿嘧啶（5-Fu）、長春新堿（VCR）、足葉乙甙（VP-16）、紫杉醇（PTX）、表阿霉素（eADM）、羥基喜樹堿（HCPT）、奧沙利鉑（L-OHP）、順鉑（DDP）、甲氨蝶呤（MTX），藥物終治療濃度為血漿峰值藥物濃度。接種細胞懸液200μL/孔，微量振蕩器振蕩混勻，置于37.0 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱培養48 h，加MTT（5 g/L）20μL/孔，繼續培養24 h，當顯微鏡下觀察到MTT還原形成藍色針狀結晶時終止培養。細胞培養板以1000 r/min離心10 min，棄上清，加入二甲基亞砜（DMSO）100μL/孔，振蕩混勻，酶標儀570 nm測各孔吸光度（A）值。腫瘤細胞平均抑制率（IR，%）=（1-給藥孔平均A值/對照孔平均A值）×100%。

1.4 統計學處理方法 應用SPPS13.0統計軟件分析。凋亡相關蛋白之間的相關分析采用秩相關檢驗，并計算Spearman相關系數，藥物抑制率以±s表示，采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 直腸癌Survivin、bcl-2、bax表達 48例直腸癌Survivin、bcl-2、bax強陽性表達率分別為72.9%（35/48）、35.4%（17/48）、47.9%（23/48），詳見表1。3種蛋白表達之間的關系：Survivin與bax間表達強度呈負相關（r=-0.37112，P＜0.01），bcl-2與bax間表達強度亦呈負相關（r=-0.37112，P＜0.01）。

2.2 直腸癌Survivin、bcl-2、bax表達與化療藥物敏感性之間的關系 Survivin強表達時，eADM、DDP對腫瘤細胞的抑制率分別明顯降低（t=2.464，P＜0.05；t=2.118，P＜0.05），但L-OHP對腫瘤細胞的抑制率則明顯增加（t=-2.079，P＜0.05）；bcl-2強表達組的5-Fu、PTX、eADM對腫瘤細胞的抑制率明顯低于弱表達組（t=2.588，P＜0.05；t=2.316，P＜0.05；t=2.139，P＜0.05）；bax強表達組中，5-Fu、eADM、L-OHP和MTX對腫瘤細胞的抑制率明顯高于弱表達組（t=-3.289，P＜0.01；t=-2.365，P＜0.05；t=-2.112，P＜0.05），見表1。

3 討論

早期直腸癌治療效果好，但晚期直腸癌缺乏特別有效的治療方法，目前主要以全身化療為主[4]。由于對化療藥物MDR的存在，直腸癌在施行根治性手術和輔助化療后，發生轉移率仍較高[5]。研究[6-8]證實，5-Fu、VCR、VP-16等多種臨床常用化療藥物均可通過干擾核酸的合成或（和）誘導細胞凋亡而發揮抑制腫瘤的作用。最近研究表明，凋亡是化療藥物發揮化療藥物毒性的最初作用形式，而抑制凋亡信號途徑是化療藥物發生耐藥的機制之一[9]。在當今研究的凋亡蛋白中，Survivin與bcl-2與直腸癌細胞凋亡關系較為密切，通過對半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase）的抑制，Survivin可阻止細胞的凋亡，致使MDR發生[6]。另外，bcl-2蛋白家族可以調節線粒體外膜的穩定性，抑制線粒體途徑誘導的細胞凋亡，從而導致MDR。本研究所選的9種受試化療藥物中，直腸癌細胞對5-Fu、PTX、eADM、L-OHP及DDP的耐藥與Survivin、bcl-2過表達相關：Survivin高表達時腫瘤與eADM、L-OHP、DDP耐藥相關；bcl-2高表達時與5-FU、PTX、eADM耐藥相關。本研究證實了Survivin、bcl-2表達與部分化療藥物敏感性相關，也證實Survivin、bcl-2可能通過作用于凋亡通路的不同靶點，從而抑制藥物引起的細胞凋亡。

表1 直腸癌組織Survivin、bcl-2、bax表達與化療藥物抑制率之間的關系（±s，%）

表1 直腸癌組織Survivin、bcl-2、bax表達與化療藥物抑制率之間的關系（±s，%）

與各自的弱表達組比：aP＜0.05，bP＜0.01

蛋白表達例數化療藥物抑制率HCPT L-OHP DDP MTX 5-Fu VCR VP-16 PTX eADM Survivin弱表達 13 22.43±4.6518.65±10.3428.39±8.9425.78±9.4825.12±9.20強表達 35 23.48±7.4717.98±11.2229.68±9.0723.65±8.2216.09±7.78a bcl-2弱表達 31 29.66±5.7826.56±8.8722.76±5.9431.54±7.3229.43±5.20強表達 17 22.43±4.65a18.65±10.3428.39±8.9623.78±9.48a22.12±1.29a bax弱表達 25 22.53±7.9916.74±7.6720.32±10.2233.98±7.1821.74±5.22強表達 23 28.85±6.37b17.98±8.6224.19±7.3834.65±8.7327.92±7.91a 25.73±6.6920.63±9.8827.49±10.4321.72±9.38 27.49±10.9128.82±8.75a22.62±8.43a20.55±8.82 28.62±11.3131.42±7.4820.48±8.7125.61±10.41 29.44±6.9528.65±7.4619.83±9.4924.22±5.59 26.40±10.8322.68±10.6322.73±13.1220.92±12.16 24.88±7.2328.19±4.98a20.63±8.8426.72±13.18a

bcl-2和bax基因是與細胞凋亡關系最為密切的凋亡基因，二者具有同源性，bcl-2是凋亡抑制基因，bax是促凋亡基因[10]。本研究結果顯示，直腸癌組織中bax與Survivin表達呈負相關，可能與二者有著共同的作用通路，有拮抗作用有關[11]。本研究還證實了，bax強表達時5-Fu、eADM、L-OHP、MTX 4種藥物對直腸癌的抑制率增強，其中eADM對腫瘤的抑制與Survivin、bcl-2、bax這3種蛋白均無關，說明這3種蛋白可能通過共同的作用機制致使腫瘤對eADM耐藥。本研究通過檢測直腸癌組織中Survivin、bcl-2、bax表達情況并分析與化療藥物抑制率之間的關系，闡明了某些化療藥物的耐藥性可能與相關凋亡蛋白的過表達有關，這為以后闡明抗癌藥物的耐藥具體機制奠定了基礎，也為以后提高抗癌藥物的療效并制定合理的抗癌對策提供了新的方向與思路。

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