干擾素γ對大鼠肺纖維化轉錄因子GATA3的影響

涂軍偉，趙建平，朱景倩，盛琳，章義利

（1.金華市中心醫院 呼吸科，浙江 金華 321000；2.溫州醫學院附屬第二醫院 ICU，浙江 溫州325000）

近來有研究表明轉錄因子GATA3在肺纖維化的發生發展中有重要作用[1]。有研究表明，干擾素γ（IFN-γ）對人和動物的肺纖維化有一定的防治作用，但機制仍不明了。本研究檢測大鼠肺纖維化模型外周血單個核細胞（PMBC）GATA3 mRNA的表達，從而探討IFN-γ干預肺纖維化的機制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠70只（由金華市藥檢所提供），體質量195～305 g，平均（250±50）g；博萊霉素（BLM）A5粉針（哈爾濱博萊制藥有限公司，H23021807）；IFN-γ針，大鼠干擾素-γELISA Kit（上海晶美生物技術有限公司）；寶生物 rTaq酶及配套試劑；GATA3引物及探針均由上海基康公司合成，序列如下：正向引物：5’-CACAGAAGGCAGGGAGTGTGT-3’，反向引物：5’-CAGGCGTTGCAAAGGT AGTG-3’，TaqMan探針：5’-FAM-TACCCCACTGTGGCGGC GAGA-TAMRA-3’，長度均為90 bp。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立及分組：雄性SD大鼠隨機方法分為正常對照組（C組）10只、BLM組30只、BLMIFN組30只。BLM組以腹腔內給藥法復制大鼠肺纖維化模型[1]，即每日腹腔內注射15 mg/kg BLM共10 d；對照組每日腹腔內給予0.1 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液共10 d。BLM組分別于造模的第7天、第14天、第28天各處死10只（相應為BLM1、BLM2、BLM4組）；BLM-IFN組在BLM造模后當天開始以IFN-γ肌肉注射，劑量為15萬IU·kg-1·d-1，直至實驗全程結束，分別在第7天、第14天、第28天各處死大鼠10只（相應為BLM-IFN1、BLM-IFN2、BLM-IFN4組）。

1.2.2 動物的處死和標本的收集：各組大鼠行頸動脈放血處死，分離出氣管和肺，左下肺用手術線結扎，取左下肺置于10%中性甲醛溶液中浸泡固定，經脫水，石蠟包埋切片，按常規程序行HE染色，進行病理組織學檢查。

1.2.3 肺組織病理組織學檢查：按Maeyama[1]方法：在光鏡（4×10）下評估每張切片上肺泡炎和肺纖維化的面積，分成0、I、II、III級，分別對應分值0分、1分、2分、3分，具體標準如下：0級，肺組織結構正常，無肺泡炎和肺纖維化；I級，肺泡炎和肺纖維化累及肺組織＜25%；II級，肺泡炎和肺纖維化累及肺組織25%～50%；III級肺泡炎和肺纖維化累及肺組織＞50%。

1.2.4 PMBC轉錄因子GATA3 mRNA的表達檢測：取大鼠靜脈血1.5 mL，梯度離心法分離PMBC，使用Bio-Rad Nucleospin RNA Pu-rification Kit進行總RNA抽提，操作流程按試劑盒說明書進行。一步法進行逆轉錄，取總RNA 2μg，Oligo(dT)15 2μL，加DEPC水至18μL，混勻、離心后70 ℃ 5 min中止反應，冰水浴 3 min；體系中繼續加入5×M-MLV Buffer 8μL，10 mmol/L dNTP 2μL，40 U/μL RNasin 1μL，200 U/μL M-MLV 2μL，總體積40 μL。混勻、離心后42 ℃ 60 min中止反應，95 ℃10 min，產物-18 ℃保存備用。采用TaqMan PCR探針法進行。反應體系如下：20 mol/L TaqMan Probe 0.625μL，20 mol/L primer forward 1.125μL，20 mol/L primer reverse 1.125μL，H2O 7.625 μL，ABI TaqMan 2 PCR Mas-ter mix 12.5μL，Template 2μL，總體積25μL。每次檢測設置3個NTC（No Template Control）。把制備好的待測樣品加入96孔板中，每個樣品進行3個平行樣實驗，PCR反應程序如下：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；進入循環：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。β-actin作為內參，將待測基因Ct值與內參Ct值的差值作為ΔCt值。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS10.0統計軟件包進行統計，計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較用q檢驗。病理半定量資料采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺病理組織學改變 C組肺組織結構正常（見圖1）；BLM組1周時以肺泡炎為主，肺泡間隔增寬，肺間質及肺泡內有較多的巨噬細胞和淋巴細胞浸潤，伴有水腫和輕度出血（見圖2）；2周時肺泡內炎性細胞減少，成纖維細胞增多，肺泡間隔增寬（見圖3），BLM1與BLM2二組病理結果差異有統計學意義（P＜0.05）；4周時以肺纖維化為主，肺泡壁增厚，部分肺泡腔消失，肺泡結構破壞（見圖4），BLM1與BLM4二組病理結果差異有統計學意義（P＜0.01）。在使用BLM致大鼠肺纖維化時同時加用外源性IFN-γ治療，則大鼠肺組織病理變化表現不同，BLM-INF1組與BLM1組比差異無統計學意義（P＞0.05），仍以肺泡炎為主，但在BLM-INF2及BLM-INF4組中發現肺纖維化程度減輕（見圖5），與BLM組比差異均有統計學意義（均P＜0.05），而C組和BLM各組及BLM-INF各組病理學對比差異均有統計學意義（均P＜0.01）。各組大鼠肺組織病理半定量分析見表1。

2.2 PMBC轉錄因子GATA3 mRNA的表達檢測 PMBC轉錄因子GATA3 mRNA的表達檢測表明各BLM組△Ct-GATA3值（BLM1、BLM2、BLM4各組△Ct-GATA3值分別為11.36±0.52、8.38±0.68、8.39±0.52）均低于C組（11.99±1.14）（均P＜0.01），BLM4組及BLM2組的△Ct-GATA3值均低于BLM1組（均P＜0.01），但BLM4組與BLM2組兩組間的△Ct-GATA3值差異無統計學意義（P＞0.05），提示BLM使GATA3基因的表達在初始的2周內顯著增高。BLM-IFN1、BLM-IFN2、BLM-IFN4各組△Ct-GATA3值分別是12.14±0.40、13.74±0.43、12.93±0.51，IFN-γ干預第1周時，和BLM1組差異無統計學意義（P＞0.05），但在第2周以后，大鼠GATA3基因表達則顯著減少，甚至低于C組（P＜0.01）。

圖1 SD大鼠肺組織正常光鏡下表現（4×10）

圖2 BLM誘導1周時，大單核細胞、淋巴細胞浸潤，肺泡間隔少許纖維組織增生，間隔增寬（10×20）

圖3 BLM誘導2周時，纖維組織增生，單核細胞、淋巴細胞浸潤，肺泡間隔增寬（較典型的中度肺纖維化病理改變）（10×10）

表1 大鼠肺組織病理半定量分析

3 討論

肺纖維化是一種發展隱匿、進展迅速、病死率和致殘率高且治療效果欠佳的慢性肺部疾病，尋找有效的治療方法及藥理學機制是目前該疾病研究的一個熱點。

本實驗利用BLM誘導大鼠肺纖維化模型，起初1周內表現為肺的炎癥細胞浸潤，纖維化成分較少，2周后纖維化成分增多而炎癥細胞消退，與有關實驗結果[2]相似。雖然肺纖維化的發病機制尚不明確，但目前認為主要與Thl/Th2型細胞因子比例失衡密切相關[3-4]。轉錄因子GATA3是一種相對分子質量為30000 Da的蛋白質，主要表達于淋巴細胞，少數由嗜酸性粒細胞合成，在肺纖維化疾病的發生中也有重要意義[1]。本實驗結果表明肺纖維化時GATA3顯著升高，也提示GATA3在肺纖維化過程中起重要作用，其可能的機制是GATA3僅在Th2中特異性表達，通過IL-4/STAT6（信號轉錄及轉錄活化因子6）使GATA3表達增加。活化的GATA3進入細胞核，導致IL-4基因座位染色質重構，增加Th2類細胞因子（如IL-4和IL-5）產生，下調STAT4及IL-12β鏈受體表達，從而促進Th2分化，抑制Thl分化，表現為Th2細胞因子優勢型變化[5-7]。研究表明肺纖維化時患者血清IFN-γ顯著減少。本實驗結果提示外源給予IFN-γ能顯著改善肺纖維化程度，降低GATA3基因的表達，從而逆轉業已優勢化Th2的激活，恢復Th1/Th2的平衡，減緩肺纖維化的發展，這為IFN-γ治療肺纖維化提供了一個理論依據。

圖4 BLM誘導4周時，肺泡腔內纖維機化，多種炎癥細胞浸潤（重度肺纖維化表現）（10×20）

圖5 BLM+IFN 2周時，輕度纖維化（10×10）

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