步長腦心通通過下調ASIC1a發揮對局灶性腦缺血再灌注的保護作用

張楠，褚鶴齡，唐宇平，董強，任惠

（1.昆明醫科大學第一附屬醫院 神經內科，云南 昆明 650000；2.華山醫院 神經內科，上海200040）

近年來研究表明，步長腦心通在實驗研究及臨床治療上對缺血性腦血管疾病的療效明確[1-3]。腦缺血損傷機制中酸敏感離子通道（acid-sensing ion channels，ASICs）[4]被激活導致胞內Ca2+超載，促使腦細胞的大量死亡。大量研究提示ASICs中ASIC1a介導了腦缺血中神經元的凋亡過程[5]。本實驗采用大鼠短暫性大腦中動脈阻塞模型，研究步長腦心通對腦缺血再灌注損傷的作用及該作用是否通過調節ASIC1a實現。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 腦心通超微粉（陜西步長制藥有限公司），紅四氮唑（TTC）染色液（美國Sigma公司），依文思藍（EB）染色液（美國Sigma公司），末端脫氧核苷酸轉移酶介導的duTP缺口標記（TUNEL）試劑盒（Roche公司，Mannheim，Germany），兔抗大鼠ASIC1a抗體（Adi公司），HRP標記的羊抗兔IgG（優寧維公司）。

1.2 實驗動物、分組及模型建立 本實驗采用健康雄性SD大鼠90只（上海斯萊克實驗動物有限公司），體質量250～300 g。隨機分為假手術組、MCAO組、腦心通組，每組30只。根據Zea Longa[6]改良線栓法建立大鼠暫時性大腦中動脈阻塞（tMCAO）模型，出現神經功能缺損視為造模成功。假手術組除不插線外，全過程等同對照組。90 min后拔線恢復再灌注，腦心通組給予步長腦心通超微粉0.5 g/（kg·d）（4 mL 0.9%氯化鈉溶液溶解）灌胃（劑量根據預實驗確定），假手術組、MCAO組給予等體積0.9%氯化鈉溶液。術前3 d起給藥，術后每天1次，直至處死。

1.3 神經系統疾病嚴重程度評分（NSS）每組大鼠于處死之前按照Chen等[7]的方法進行NSS評分，該評分是一種運動、感覺、平衡和反射功能的綜合性評分指標。最低0分，1～6為輕度，7～12為中度，13～18為重度損害，最高18分。

1.4 測量梗死體積 在相應各時間點將各組大鼠斷頭取腦，迅速冰凍10 min，去除嗅球、小腦和低位腦干，連續切片成6片，每片厚度為2 mm，置于2% TTC液中染色30 min，4%多聚甲醛固定24 h后用數碼相機照相。可見紅色正常組織和白色梗死組織。用Image Tool 3.0軟件計算梗死體積。

1.5 測定腦含水量 在相應各時間點將各組大鼠斷頭取腦組織，迅速除去嗅球、腦干、小腦，取梗死同側半球。準確稱得濕重后置100 ℃烤箱中烘烤至恒重后稱取干重，根據以下公式計算腦組織含水量百分比：腦組織含水量=（濕重－干重）/濕重×100%。

1.6 測定血腦屏障通透性 在相應各時間點將各組大鼠經尾靜脈注入2% EB液4 mL/kg，1 h后以10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，心內灌注0.9%氯化鈉溶液200 mL，迅速斷頭取腦，取梗死同側半球稱濕重后置于甲酰胺（1 mL/100 mg腦組織）中，60 ℃孵育24 h。1000 r/min離心5 min，吸取上清液置于比色杯中，紫外分光光度計比色（λ=632 nm），蒸餾水為空白對照液，測定上清液吸光度A值。根據已知EB濃度建立標準曲線，根據標準曲線求得EB含量（μg/g）。

1.7 TUNEL染色 將各組大鼠在相應時間點麻醉、開胸，用0.9%氯化鈉溶液和4%多聚甲醛依次心內灌注固定。斷頭取腦，梯度脫水后用OTC包埋劑包埋，冷凍后，用冰凍切片機作連續冠狀切片，片厚10μm。按照TUNEL試劑盒說明書操作。封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。在400倍高倍鏡下隨機觀察并計數梗死周圍6個不重疊視野的TUNEL陽性細胞，取其平均值作為計數值。

1.8 Westem blot法測ASIC1a表達水平 將各組大鼠于相應時間點處死，取缺血核心區腦組織提取總蛋白，考馬斯亮藍測定蛋白濃度，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠不連續電泳分離，轉膜至硝酸纖維膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，再分別加入兔抗大鼠ASIC1a一抗孵育。4 ℃孵育過夜。再分別加入HRP標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1.5 h后，放入ECL反應液室溫孵育5 min，以X線膠片曝光。免疫印跡的圖譜經Image proPlus 5.02圖像軟件分析。

1.9 統計學處理方法 采用SPSS12.0統計軟件，數據以±s表示。多組間用單因素方差分析與Newman-Kueuls檢驗，兩組間比較用兩樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能評分 假手術組動物無明顯神經功能缺損，MCAO組、腦心通組均有不同程度的神經功能缺損。與MCAO組相比，腦心通組大鼠各時間點神經功能評分顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組不同時間神經功能評分比較（n=6）

2.2 梗死體積 假手術組無明顯梗死灶。與MCAO組比較，腦心通組各時間點梗死體積均有顯著減少（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組不同時間梗死體積比較（n=6）

2.3 腦含水量 與假手術組比較，MCAO組和腦心通組1、3和7 d腦含水量均有升高，與MCAO組比較，腦心通組各時間點腦含水量均有顯著減少（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組不同時間腦組織含水量比較（n=6）

2.4 EB含量 與MCAO組比較，腦心通組各時間點EB含量均有顯著降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組不同時間腦組織EB含量比較（n=6）

2.5 TUNEL染色 MCAO組和腦心通組均可見TUNEL陽性細胞。與MCAO組比較，腦心通組各時間點TUNEL陽性細胞數量均有顯著減少（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組MCAO 3 d梗死周邊TUNEL染色熒光圖及比較

2.6 ASIC1a表達水平 Western bolt法檢測結果顯示，與假手術組相比，MCAO組ASIC1a表達量顯著增高（P＜O.05）。腦心通組的ASIC1a表達量3 d、7 d與MCAO組比顯著下降（P＜O.05）。見圖6-7。

圖6 各組不同時間ASIC1a蛋白Western blot法檢測圖像

圖7 各組不同時間Western blot法檢測ASIC1a半定量分析（n=6）

3 討論

步長腦心通是由黃芪、川芎、全蝎、地龍、水蛭等十六味中藥根據中醫補陽還五湯理論研制而成的復方制劑，具有益血活血、化瘀通絡之功效，可以有效減少心腦缺血損傷[8]。本實驗結果顯示步長腦心通可改善腦缺血大鼠神經功能，減少梗死體積，減輕腦水腫，保護血腦屏障完整性，減少梗死周邊凋亡細胞數量等作用，與以往研究結果一致。既往關于腦心通保護腦缺血的機制的研究包括，影響一氧化氮合酶[9]、血管內皮生長因子[10]表達，抑制炎性細胞因子TNF-α、IL-1β[11]、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，mMP）MMP-2、MMP-9[12]、凋亡效應子Caspase-3[13]的表達，從而發揮抵抗血小板聚集，保護神經元，營養保護血管內皮細胞，減輕缺血區周圍炎癥反應，減輕血管周圍的滲出和水腫的作用。而本實驗首次探討步長腦心通是否通過對ASIC1a的影響發揮作用。

發生腦缺血時，腦組織供氧不足導致糖酵解增加。嚴重情況下，其產物的積聚使局部缺血腦組織周圍的pH值快速下降至6.10，從而充分激活ASIC1a通道。Li等[14]在皮層培養物細胞上利用膜片鉗技術證明局部缺血通常會激活ASIC電流。腦內ASIC1a高水平表達，介導Ca2+內流[15]，產生的酸性代謝產物和Ca2+超載破壞腦神經元蛋白質、脂類及核酸，進一步導致細胞損傷和死亡[16]。研究證實，腦室內注射ASIC1a阻斷劑或剔除ASIC1a基因能抑制酸誘導的腦損傷，腦梗死體積顯著減少[17]。上述實驗均表明，ASIC1a可能參與了腦缺血后損傷作用。本實驗檢測到，腦缺血1 d后，ASIC1a的表達即開始上升，并在3 d達到高峰，說明損傷可誘導ASIC1a表達。而腦心通不影響MCAO 1 d后ASIC1a的表達，在3 d、7 d可顯著抑制ASIC1a表達。故推測，下調ASIC1a表達可能參與了步長腦心通對亞急性期、而非急性期腦缺血的保護作用。Gao等[18]實驗發現，在腦缺血過程中谷氨酸受體和ASIC1a發揮協同作用。另有研究顯示鈣調素依賴性蛋白激酶II依賴性ASIC1a的磷酸化在誘導神經元死亡中起主要作用[19]。而步長腦心通是否通過以上等方面作用于ASIC1a尚有待進一步研究。

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