NR4A1基因的克隆及真核表達載體的構建

王良國，黃曉燕，林素，潘嘉林，戴曉春，王本極，吳漪浩，楊德業

（溫州醫學院附屬第一醫院 心內科，溫州醫學院 心血管生物和基因研究所，浙江 溫州 325000）

室間隔缺損（ventricular septal defect，VSD）是一種常見的先天性心臟病，但至今對其致病因素及發病機制仍知之甚少。轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）在胚胎發育和細胞分化中起重要作用，骨形態形成蛋白受體IA（bone morphogenetic protein receptor IA，BMPIA又名ALK3）屬于TGF-β超家族，在心臟發育及心肌細胞分化中起重要作用[1-2]。美國Schneider教授創建了心臟特異的ALK3基因敲除的小鼠模型，僅在心臟敲除ALK3基因[3]，發現純合子小鼠死于胚胎中期，并伴有VSD，心內膜墊和肌小梁發育不全[4]。ALK3基因在調控心臟發育和心肌細胞凋亡過程中起重要作用。楊德業教授實驗室利用基因芯片篩選ALK3的下游基因，發現轉錄因子Pax-8在ALK3基因敲除的純合子小鼠胚胎心臟中下調了7.1倍[5]，周希等[6]已證明Pax-8基因參與了心臟的發育，并通過抑制心肌細胞的凋亡而參與胚胎心臟的發育，而黃曉燕等[7]利用基因芯片檢測小鼠基因表達水平，篩選出差異表達的基因，找到了Pax-8的下游基因NR4A1，其受Pax-8基因調控，在Pax-8保護細胞凋亡途徑中發揮作用。為了進一步研究Pax-8下游基因NR4A1與心肌細胞凋亡之間的聯系，本研究通過克隆NR4A1全長序列，構建含NR4A1基因的真核表達載體，為探討NR4A1在心肌細胞凋亡過程中的功能做準備。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 Pax-8基因敲除小鼠模型由德國Peter Gruss和Ahmed Mansouri教授惠贈；Trizol、LipofectamineTM2000轉染試劑、DEPC水（RNase-free and DNase-free）及各個PCR引物均購自Invitrogen公司；FBS、DMEM（low glucose）、0.05%胰酶/EDTA、Hanks均購自Gibco；RT試劑盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）、Dnase I（Rnasefree 1 U/μL）購自MBI Fermantas公司；大鼠H9C2心肌細胞株購自中科院上海細胞庫；高保真DNA聚合酶Prime STARTM HS DNA Poly-merase購自TAKARA公司；限制性內切酶購自NEB公司；DH5a菌種、超級感受態細胞制備試劑盒購自碧云天生物技術研究所；質粒抽提試劑盒購自Omega；T4連接酶購自Promega；PCR試劑盒（SYBR Green Realtime PCR Master Mix）、封板膜及96孔板購自ABI公司；兔抗鼠NR4A1（NUR77）多克隆抗體購自abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 Pax-8敲除小鼠的基因型鑒定：用雌性Pax-8 KO+/-（雜合型）小鼠與雄性Pax-8 KO+/-（雜合型）小鼠交配可獲得Pax-8 KO-/-（純合子型）和Pax-8 KO+/-（雜合子型）以及Pax-8 KO+/+（野生型）小鼠。并利用PCR鑒定出Pax-8 KO-/-（純合子型）。引物為5’-GGATGTGGAATGTGTGCGAGG-3’，5’-GCTAAGAGAAGGT GGATGAGAG-3’，和 5’-GATGCTGCCAGTCTCGTAG-3’。PCR條件：第一步：94 ℃預變性 5 min，94 ℃變性15 s， 60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，10個循環。第二步：94 ℃變性15 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，25個循環，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.2 NR4A1基因的cDNA克隆：用TRIzol試劑提取Pax-8 KO-/-（純合子型）小鼠心臟組織總RNA，并經瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質量，以此為模板，oligo dT為引物逆轉錄合成cDNA。依據GeneBank中小鼠NR4A1的基因序列設計引物，上游（S1）：5’-ATGCCCTGTATTCAAGCTCAATA-3’，下游（A1）：5’-TCAG AAAGACAATGTGTCCATAA-3’，用高保真DNA聚合酶Prime STARTM HS DNA Polymerase擴增NR4A1序列，NR4A1 PCR反應條件：94 ℃預變性變性5 min后，98 ℃變性10 s，56.4 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，循環36次，最后延伸5 min。將PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，并回收NR4A1條帶，利用LATaqDNA酶在3’端加上poly A尾，然后與pGEM-T Easy載體連接后，轉化到DH5α，經過藍白斑篩選，挑取數個陽性克隆菌落搖菌后，測序鑒定，鑒定序列比對后正確。

1.2.4 脂質體轉染：轉染前1 d，將1×105/孔細胞接種至6孔板中，然后按Lipofectamine 2000說明書進行轉染。轉染6 h后，用含有10% FBS的DMEM換液，在培養箱中培養48 h。實驗分3組：①實驗組（PZ-NR4A1組）：細胞轉染1.2μg pIERS2-ZsGreen1-NR4A1重組載體為實驗組；②陰性對照組（NC組）：細胞轉染1.2μg pIERS2-ZsGreen1空載體作為陰性對照組；③空白對照組（BC組）：給予常規培養液，未做其他處理。

1.2.5 熒光實時定量PCR檢測轉染后NR4A1的mRNA表達水平：細胞轉染48 h后，用TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，然后用RevertAidTM First StrandcDNA Synthesis Kit逆轉錄合成cDNA，以此為模板進行熒光實時定量PCR。熒光實時定量PCR引物，NR4A1：上游SSS1：5’-GGGTGACCCCACTATTTGTC’-3’，下游SSA1：5’-CGGAAGAGATCTCGAGTTGG-3’，GAPDH：上游：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，下游：5’-GGC ATGGACTGTGGTCATGAG-3’。再利用ABI 7500 FAST 型熒光實時定量PCR儀進行定量檢測。PCR條件：95 ℃15 s，60 ℃ 60 s，共40個循環，以GAPDH作為內參，進行歸一化，各組生物學重復三次。數據分析利用美國Biosystems公司的Sequence Detec-tion system（SDS）2.2.2軟件進行。樣本目的基因的相對表達率（relativeexpression，RQ）采用△△CT方法計算，RQ＝2-△△CT（CT表示PCR 擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環數），△CTsample＝CTsample-CT /GAPDHsample，△CTcontrol＝CTcontrol-CT/GAPDHcontrol，△△CT＝△CTsample-△CTcontrol）

1.2.6 Western blotting法檢測轉染后NR4A1蛋白表達水平：轉染48 h后，用RIPA裂解細胞提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，各組上樣30μg，然后進行電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。一抗（NUR77 antibody 1:1000），4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，每次10 min。室溫下加入IgG抗體（1:4000）孵育1.5 h，洗膜3次，每次10 min，用Odyssey近紅外雙色激光成像系統選擇800通道進行掃描條帶，以GAPDH作為內參標化NR4A1蛋白質表達，各組技術、生物學各重復三次。用Quantity One凝膠成像分析系統進行半定量分析。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS 17.0軟件完成統計學分析。計量資料以±s表示，實驗數據經過方差齊性檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，獨立的兩組間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Pax-8基因敲除小鼠基因型的鑒定 Pax-8純合子型為約370 bp的條帶，Pax-8雜合型為390 bp和370 bp兩條條帶，Pax-8野生型為約390 bp的條帶。見圖1。

圖1 Pax-8基因敲除小鼠基因型的鑒定

2.2 NR4A1基因的cDNA克隆 從Pax-8基因敲除小鼠中取出心臟組織，提取mRNA后用Fermantas逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA，在PCR儀上進行擴增后，在1.2%的瓊脂糖凝膠上分離，在1800 bp處可以見到特異性條帶（見圖2），用QIAquick膠回收試劑盒回收后，與pGME-T Easy載體連接，轉化到DH5α感受態細菌，在含X-Gal-IPTG的LB培養板上挑取陽性單克隆，經16 h搖菌后，將菌液送至華大基因公司測序，測序結果與pubmed上公布的NR4A1序列一致。

圖2 NR4A1基因擴增

2.3pIERS2-ZsGreen1-NR4A1真核表達載體的初步構建 以pGME-T Easy-NR4A1為模板，在PCR儀上進行擴增，擴增后在1.2%的瓊脂糖凝膠上分離，在1800 bp處可以見到明顯特異性條帶（見圖3），與設計相符。再次進行膠回收，與pIERS2-ZsGreen1載體連接后，轉化到感受態細菌，經藍白斑篩選后，挑取陽性克隆進行快速PCR鑒定，在300 bp左右見到明顯條帶。見圖4。

圖3 NR4A1基因再擴增

圖4 NR4A1基因初步鑒定

2.4 NR4A1真核表達載體的酶切與測序鑒定 將陽性克隆菌液擴增后，提取質粒，經EcoRI、BamHI進行雙酶切后，在瓊脂糖凝膠上分離，預期切出約1800 bp的NR4A1片段帶和約5.3 kb的載體帶。結果如圖5所示，與預期一致。將陽性克隆送到華大基因公司測序，將測序所得的序列和GeneBank中NR4A1基因片段序列進行比對，顯示構建序列與預計堿基序列一致，因此pIERS2-ZsGreen1-NR4A1構建成功。

圖5 pIERS2-ZsGreen1-NR4A1雙酶切

圖6 實時定量PCR檢測NR4A1 mRNA的表達水平

2.5 熒光實時定量PCR檢測轉染后NR4A1的mRNA表達水平 與BC組（1.00±0.00）相比，PZ-NR4A1組（2.62±0.21）NR4A1 mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05），與NC組（0.99±0.16）相比，PZ-NR4A1組NR4A1 mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05），而BC組和NC組 mRNA表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖6。

2.6 Western blotting法檢測轉染后NR4A1蛋白表達水平 PZ-NR4A1組（0.72±0.11）與BC組（0.17±0.07）相比，NR4A1的蛋白表達量明顯升高（P＜0.05），PZ-NR4A1組（0.72±0.11）與NC組（0.21±0.08）相比，NR4A1的蛋白表達量也明顯升高（P＜0.05），而BC組和NC組相比，NR4A1的蛋白表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖7。

圖8 Western blotting法檢測NR4A1蛋白的表達水平

3 討論

先天性心臟病是由于胎兒時期心臟血管發育異常所導致的心血管畸形。其發病率大約占出生嬰兒的0.8%，研究表明其主要原因可分為遺傳因素和環境因素兩類，包括染色體易位與基因畸變、大劑量放射性射線接觸、宮內感染以及藥物等因素。心臟發育是一個既復雜又連續的過程，是一系列生長分化因子和轉錄因子參與調節的。先天性心臟病輕者無癥狀，在查體時可被發現，重者則有紫紺、活動后呼吸困難、暈厥等。隨著年齡的增長，可有生長發育遲緩。 根據血液動力學以及病理生理的變化，可將先天性心臟病分為三類：①無分流類。②左至右分流類。③右至左分流類。VSD是常見的先天性心臟病，約為先心病總數30%，而先天性VSD是否與某一特定基因異常有關，為此楊德業教授實驗室利用基因芯片篩選ALK3的下游基因，發現轉錄因子Pax-8，而Pax-8基因參與胚胎心臟的發育。再利用基因芯片篩選了Pax-8基因敲除小鼠的下游基因，發現了NR4A1的高表達。NR4A1又稱Nur77、GFRP1、NGFI-B等，是一種轉錄因子，是核受體超家族一員，目前未發現其配體，故又稱為孤兒核受體，從氨基端到羧基端，一共有4個結構域組成。NR4A1在多種組織中表達，具有比較復雜的生物學功能。NR4A1不僅參與細胞周期調控，還與類固醇激素的生成、腫瘤以及動脈硬化的形成密切相關，故NR4A1的作用比較廣泛， 在細胞凋亡、細胞增殖、甾體激素合成等諸多方面發揮作用[8]。其與不同的輔助因子相互作用，可使下游的基因表達激活或者抑制。國內外研究表明，若細胞受到促進生長分裂的分子信號刺激，NR4A1能調節各種促進細胞增殖的基因表達；若細胞受到促進細胞凋亡的分子信號刺激時，NR4A1通過磷酸化，從細胞核內轉移至線粒體，并與Bcl-2相互作用，可使Bcl-2分子由一個保護因子變為殺傷因子，并觸發細胞色素C釋放，而激活細胞凋亡[9]。在Pax-8基因敲除的小鼠模型中，其心肌細胞凋亡明顯增高。

NR4A1與Pax-8基因敲除小鼠心肌細胞的凋亡相關，在心肌細胞凋亡的模型中，NR4A1的表達量明顯升高。由此可以推斷當Pax-8基因敲除后，保護心肌細胞的因素減弱，而促進細胞凋亡的因素增強，從而使NR4A1磷酸化，而導致心肌細胞的凋亡，繼而出現VSD，導致先天性心臟病的發生。我們的研究目的就是想找尋與引起VSD密切相關的通路，當這條通路上的基因被激活或抑制后，心肌細胞會出現怎樣的生長情況，從而為基因治療先天性心臟病奠定基礎。本實驗通過基因重組技術，成功構建了含NR4A1基因全長的真核表達載體，并且能在細胞中成功表達蛋白，這為進一步探索NR4A1的生物學功能及確定與先天性心臟病的相關程度奠定了基礎。此外實驗中的真核表達載體pIERS2-ZsGreen1攜帶有GFP，在質粒轉化后，通過熒光顯微鏡觀察轉染是否成功及轉染效率，為之后進一步的穩定轉染實驗研究提供了方便。

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