癸氧喹酯對(duì)意蜂工蜂中微孢子蟲的抑制作用研究

王 博 吳麗麗 黃少康 羅 瑤 滕小羊 游信毅

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002）

蜜蜂是最重要的授粉昆蟲之一，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和自然界植物繁衍帶來了巨大效益。同時(shí)，蜜蜂也受多種病原的侵襲，蜜蜂微孢子蟲就是最廣泛感染成年蜂的一種傳染性病原。蜜蜂微孢子蟲主要侵染中腸組織，感染對(duì)中腸功能有顯著影響，感染工蜂的中腸凝乳蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）（Malone and Gatehouse，1998），谷胱苷肽還原酶（glutathione reductase），堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase）均會(huì)顯著下降，而谷苷胱肽S轉(zhuǎn)移酶（Glutathione-S-transferase）顯著上升（Dussaubatet al.，2012）。感染會(huì)造成工蜂個(gè)體免疫力下降，壽命縮短，群勢(shì)和生產(chǎn)力下降（黃少康等，2006；Chaimaneeet al.，2012）；它還與病毒等其他病因共同造成蜂群衰竭（Higeset al.，2008；vanEngeldorpet al.，2009）。自1996發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂微孢子蟲（Nosema ceranae）至今，在西方蜜蜂中，它已經(jīng)逐漸替代了西方蜜蜂微孢子蟲（N. apis）而成為侵染蜜蜂的主要微孢子蟲種類（Fries et al.，1996；Chenet al.，2008；劉峰等，2008）。

煙曲霉素（Fumigillin）和阿苯達(dá)唑（albendazole）是人和動(dòng)物微孢子蟲病治療中最常用，最有效的兩種藥物（Costaet al.，2000）。在北美及歐洲的西班 牙，煙曲霉素允許在蜂群中使用（Williamset al.，2011）。 酸飼料也曾用于蜂群治療，但結(jié)果并不理想（Forsgren and Fries，2005）；天然植物提取物也是人們熱衷嘗試的對(duì)象，室內(nèi)試驗(yàn)顯示，百里酚（thymol）和白黎蘆醇（vesveratrol）均能顯著抑制孢子數(shù)量，延長工蜂壽命（黃文誠，2009；Maistrelloet al.，2008；Costaet al.，2010），但在蜂群中的使用效果尚未得到廣泛確認(rèn)。

癸氧喹酯（decoquinate）是一種喹啉（quinolone）類廣譜抗球蟲藥物，又名地考喹啉酯、敵球素，化學(xué)名為6-癸氧基-7-乙氧基-4-羥基喹啉-3-羧基乙酯。癸氧喹酯是1967年英國May-Baker公司研制，對(duì)預(yù)防和治療禽類球蟲，家畜的孢子蟲、隱孢子蟲等病原有良好的效果（陳曉榮等，2010）。對(duì)人畜安全，無遺傳毒性、致畸性和繁殖毒性，據(jù)亞急性試驗(yàn)推算，人可每日允許攝入癸氧喹酯的量（ADI）為0.075mg/kg體重（聶月美等，2011）。癸氧喹酯在美國、日本，及歐洲許多國家使用于已有幾十年的歷史，但到近年才引進(jìn)中國，用于禽類球蟲病治療，效果明顯（Guoet al.，2007）。由于蜜蜂微孢子蟲與畜禽類孢子蟲有許多相似的生物學(xué)特征，本試驗(yàn)的目的是測(cè)試該藥物是否對(duì)蜜蜂微孢子蟲有抑制或治療作用。室內(nèi)測(cè)試表明，癸氧喹酯對(duì)意蜂工蜂中微孢子蟲的感染有明顯的抑制作用，同時(shí)對(duì)工蜂中腸功能無明顯不良影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 微孢子蟲懸液制備

微孢子蟲提純方法參文獻(xiàn)（黃少康等，2007）。簡要過程為：從意蜂蜂群巢門口抓取一定數(shù)量的外勤蜂，拉取中腸，經(jīng)多次差速離心純化后，獲得微孢子蟲懸液。將純化所得的微孢子蟲經(jīng)鏡檢計(jì)數(shù)后，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%蔗糖液（文中所使用的糖液均同）稀釋到4.4×106 spore/mL的濃度用于接種用。

1.2 意蜂工蜂接種與飼養(yǎng)

意蜂群由福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院教學(xué)蜂場(chǎng)提供。從健壯的蜂群中挑取老熟意蜂封蓋子脾，放入恒溫恒濕箱中（35℃、75%±15%RH）羽化，收集24h內(nèi)出房的工蜂用于試驗(yàn)。

用微量進(jìn)樣針吸的微孢子蟲懸液，逐只給工蜂經(jīng)口飼喂1μL，再放入成年工蜂室內(nèi)飼養(yǎng)盒中，放入30℃，70%±15%RH的恒溫恒濕箱內(nèi)飼養(yǎng)。每盒30只工蜂，共12盒。12盒蜂均分4組，每組3盒；3組為飼藥組，1組為對(duì)照組，對(duì)照組試驗(yàn)全程均只喂質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的蔗糖液。

從接種的第1天至第4天， 均供以蔗糖液，以促使微孢子蟲與工蜂建立感染關(guān)系。將濃度分別為2×1 0-6、1×10-5、5×10-5g/mL的癸氧喹酯（原液為2.5%，濟(jì)南 深華生物有限公司生產(chǎn)）蔗糖液作為3試驗(yàn)組的飼藥糖漿，從第5至第11天連續(xù)供給含藥糖漿一周，供工蜂自由取食。第12至第14天，全部改喂蔗糖液。

每天飼喂一次，每日記錄取食量和死蜂數(shù)。取食量測(cè)定方法：將裝好糖漿的飼料管用電子天平（精度0.0001mg）稱重，24h后取出再稱重，重量差除以每天的蜂數(shù)即為日均單只取食量。

1.3 中腸酶液制備及微孢子蟲檢查

室內(nèi)飼養(yǎng)14天后，將活蜂的中腸拉出，放入1.5mL離心管中，加入0.1mol/L乙酸鈉（pH5.0）緩沖液0.1mL，冰浴研磨，10000 r/min 4℃離心15min，上清液-70保存，用 于蛋白濃度及酶活性檢測(cè)。

離心沉淀加入100μL蒸餾水，混勻，吸取少量于400倍顯微鏡下觀察，記錄視野下微孢子蟲數(shù)，然后按每視野內(nèi)微孢子蟲數(shù)量的多少對(duì)感染嚴(yán)重程度的進(jìn)行分級(jí)：每視野內(nèi)孢子數(shù)少于10個(gè)時(shí)定為Ⅰ級(jí)，>10～30個(gè)為Ⅱ級(jí)；>30～10 0個(gè)為Ⅲ級(jí)；>100為Ⅳ級(jí)。

1.4 中腸蛋白濃度的比較

以Bradford法測(cè)定中腸蛋白濃度（汪家政等，2000）。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，在595 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定其光吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成濃度。具體地：吸取5μL中腸上清液、95μL乙酸鈉緩沖液、1mL Bradford工作液，在1.5mL管中混勻。吸250 μL于酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值，記錄樣品蛋白濃度。每樣品2個(gè)重復(fù)。

1.5 意蜂工蜂中腸α-葡萄糖苷酶相對(duì)活性比較

根據(jù)鏡檢分級(jí)結(jié)果將感染程度的不同中腸上清液分成三組：未感染、輕度感染（Ⅰ-Ⅱ級(jí)）、嚴(yán)重感染（Ⅲ-Ⅳ級(jí)），每組隨機(jī)取15個(gè)樣品。按以下方法檢測(cè)中腸葡萄糖苷酶活性：吸酶液5μL于1.5mL小管中，加入200μL 0.2mmol/L的α-pNPG溶液，40溫浴30min后。加入6 0μL的Tris 緩沖液（1.5mol/L，pH10.0）終止，冷卻至室溫，吸200μL于酶標(biāo)板中，405nm處測(cè)吸光值。相對(duì)酶活以產(chǎn)物pNPG的吸光值與蛋白量的比值計(jì)。每樣本3個(gè)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。為統(tǒng)計(jì)方便，將Ⅰ和Ⅱ級(jí)的感染合計(jì)為輕度感染，Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)合計(jì)為重度感染。感染率和感染嚴(yán)重程度的比較使用卡方檢驗(yàn)；多重比較用方差分析（one-way ANOVA，LSD）進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 癸氧喹酯蔗糖液對(duì)工蜂取食量的比較

在試驗(yàn)期內(nèi)，單只工蜂日均取食量的變化規(guī)律見圖1。

圖1 工蜂對(duì)不同濃度癸氧喹酯蔗糖液的取食量比較Fig.1 The amount of sugar water consumed by individual worker daily in different treatment of decoquinate

從圖1可知，第1天至第8天，各組蜂的日均取食量均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，這與工蜂日齡增長，活動(dòng)增加，部分組織器官發(fā)育，新陳代謝加強(qiáng)，能量需求增大的狀況相符。第8至13天，取食量較為穩(wěn)定，略有小幅度的波動(dòng)。第14日時(shí)，略有下降。方差分析表明，自第1至14天，各組之間日均取食量間均無顯著差異（P>0.05），說明，5×10-5、1×10-5、2×10-6g/mL的癸氧喹酯蔗糖糖漿對(duì)工蜂的取食量無顯著影響。

2.2 癸氧喹酯對(duì)意蜂工蜂死亡率的影響

工蜂自由取食3種濃度的癸氧喹酯蔗糖漿后，累計(jì)死亡率分別為7.8%，4.4%，2.2%，均小于10%，對(duì)照組累計(jì)死亡率為3.3%（圖2）。卡方檢驗(yàn)表明，試驗(yàn)組死亡率與對(duì)照組間均無顯著差異（P>0.05）。說明，所用藥液濃度對(duì)工蜂無明顯毒性。

圖2 癸氧喹酯對(duì)意蜂工蜂累計(jì)死亡率的影響Fig. 2 Cumulative mortality of workers after fed with Decoquinate

2.3 癸氧喹酯對(duì)意蜂工蜂微孢子蟲感染的 影響

新羽化工蜂接種微孢子蟲（4400spore/bee），4天后再分別喂3種不同濃度的癸氧喹酯7天，逐只檢查工蜂中腸有無微孢子蟲感染，結(jié)果見圖3。

卡方檢驗(yàn)表明，飼喂了5×10-5g/mL癸氧喹酯的工蜂，微孢子蟲感染的工蜂數(shù)量顯著低于對(duì)照組（χ2=4.133，P=0.042），說明，此濃度藥物可顯著降低工蜂感染率。而2×10-6、1×10-5g/mL兩濃度與對(duì)照組的感染數(shù)量無顯著差異（P＞0.05），對(duì)降低感染率方面無明顯效果。

我們知道，在不同的感染蜂中，感染程度可能存在明顯的差異，有的感染重些，有的感染輕些。因此，我們進(jìn)一步對(duì)感染蜂中感染程度差異進(jìn)行了比較，結(jié)果表明（圖4），5×10-5、1×10-5、2×10-6g/mL藥物組與對(duì)照之間均有極顯著差異（χ2=27.848，P=0.000 ；，P=0.000，χ2=7.523，P=0.006）。說明，3種濃度的癸氧喹酯均能顯著降低工蜂的感染程度，并且隨藥物濃度的增高，微孢子蟲感染程度極顯著減輕，抑制效果顯著。3種藥物效果之間比較顯示，5×10-5與1×10-5g/mL試驗(yàn)組之間無顯著差異（χ2=0.997，P=0.318），5×10-5、1×10-5g/mL 分別與2×10-6g/mL均有極顯著差異（χ2=8.467，P=0.004；χ2=3.903，P=0.048），說明，3種濃度的藥物糖漿，濃度越高，抑制效果越好。

圖3 癸氧喹酯對(duì)西方蜜蜂工蜂中微孢子蟲感染的 抑制作用Fig.3 Inhi bition effects of Decoquinate on the infection of Nosema ceranae in honeybee worker（Apis mellifera ligustica）

圖4 癸氧喹酯對(duì)西方蜜蜂工蜂中微孢子蟲感染嚴(yán)重程度的抑制作用Fig.4 Inhibitive effect of Decoquinate on the intensity of Nosema ceranae infection in honeybee worker（Apis mellifera ligustica）

2.4 癸氧喹酯對(duì)意蜂工蜂中腸蛋白質(zhì)濃度的影響

對(duì)應(yīng)工蜂中腸微孢子蟲感染程度，逐只對(duì)中腸蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 癸氧喹酯對(duì)意蜂工蜂中腸蛋白濃度的影響Table 1 Effect of d ecoquinate on the concentration of midgut protein of worker honey bee（Apis mellifera ligustica）

方差分析（one-way ANOVA）表明，在未感染蜂中，4個(gè)試驗(yàn)組之間，工蜂中腸蛋白質(zhì)濃度無顯著性差異（P＞0.05），說明在未感染蜂中，所喂 藥物對(duì)中腸蛋白濃度無顯著影響。但在輕度感染蜂中，5×10-5g/mL藥物組的中腸蛋白濃 度比對(duì)照顯著的高（P＜0.05）；在重度感染蜂中，5×1 0-5g/mL藥物組與對(duì)照無顯著差異，但比1×10-5g/mL和2×10-6g/mL的濃度都顯著高（P＜0.05）。在相同藥物濃度下，不同感染程度之間（未感染、輕度感染、重度感染）的中腸蛋白濃度無顯著性差異（P＞0.05）。說明，感染程度有差異的情 形下，不同濃度的藥物對(duì)中腸蛋白濃度的影響與感染嚴(yán)重程度差異有關(guān)。

2.5 癸氧喹酯對(duì)意蜂工蜂中腸 相對(duì)活性的影響

花蜜或蜂蜜等糖類是蜜蜂的主要能源食物，葡萄糖苷酶則是由中腸細(xì)胞分泌用于分解糖的主要酶類，中腸是蜜蜂微孢子蟲最主要的侵染場(chǎng)所。為考查試驗(yàn)藥物對(duì)工蜂中腸功能的影響，對(duì)中腸α-葡萄糖苷酶相對(duì)活性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明（表2），在無藥物的對(duì)照組中，輕度感染蜂的相對(duì)酶活顯著高于重度感染蜂（P<0.05）；也高于無感染蜂，但兩者之間未見顯著差異（P>0.05）。推測(cè)微孢子蟲感染會(huì)導(dǎo)致相對(duì)酶活增高，但不同感染程度對(duì)酶活影響程度不同。Dussaubat et al.（2012）也曾報(bào)道，微孢子蟲感染會(huì)導(dǎo)致中腸α-葡萄糖苷酶表達(dá)上調(diào)。推測(cè)這種變化可能是由于中腸細(xì)胞損傷導(dǎo)致，但對(duì)于中腸感染或損傷程度，與酶活變化之間的關(guān)系還不清楚。在重度感染蜂中，取食5×10-5g/mL藥物后，酶活與對(duì)照無顯著差異，可能是由于藥物抑制了微孢子蟲的感染，而使中腸細(xì)胞的損傷減輕，酶值恢復(fù)正常，而與對(duì)照無顯著差異。而在1×10-5和2×10-6g/mL兩飼喂組中，藥物雖然對(duì)微孢子蟲有一定的抑制作用，但與5×10-5g/mL濃度組相比，仍有顯著差異，相對(duì)酶活仍高于5×10-5g/mL試驗(yàn)組。

表2 癸氧喹酯對(duì)意蜂工蜂中腸α-葡萄糖苷酶相對(duì)活性的影響Table 2 Effect of decoquinate on the α-glucosidase relative activity of the midgut in worker honey bee（A. m.ligustica）

3 討論

本試驗(yàn)表明，短期（7天）飼喂2×10-6、1×10-5、5×10-5g/mL的癸氧喹酯對(duì)抑制籠養(yǎng)意蜂工蜂中東方蜜蜂微孢子蟲的感染有顯著的抑制作用。但對(duì)其作用原理并不清楚。據(jù)報(bào)道：在球蟲無性繁殖階段，癸氧喹酯作用于球蟲的囊合子孢子和第一期裂殖體，通過阻斷細(xì)胞色素系統(tǒng)中的電子傳遞，即從輔酶Q到細(xì)胞色 素C的傳遞過程而抑制進(jìn)入子孢子的發(fā)育。而且藥物在球蟲生活史的早期即開始發(fā)揮作用（欒明娜等，2009；聶月美等，2011）。藥物能引起柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）染色體的異常重排，使染色體畸變而導(dǎo)致孢子囊的減少（Del Cachoet al.，2006）。

藥物治療蜂病一直是一個(gè)兩難的問題。一方面，長期用藥可能會(huì)導(dǎo)致病原抗藥性產(chǎn)生，同時(shí)也有藥物殘留的風(fēng)險(xiǎn)，使得允許在蜂群中使用的抗微孢子蟲藥物種類極為有限；另一方面，微孢子蟲的廣泛感染不僅直接造成蜂群損失和產(chǎn)量下降，也損害了蜜蜂為作物授粉的農(nóng)業(yè)效益。因此，許多國家制定了相關(guān)規(guī)定，僅允許個(gè)別藥物在蜂群中的使用，同時(shí)又制定嚴(yán)格的藥殘限量來控制藥物使用。從目前的防治水平來看，科學(xué)合理地使用蜂藥，如非生產(chǎn)期用藥，合理的停藥期，提高蜂群抗病力等綜合防治措施，仍是解決重要蜜蜂病害的重要方法。

隨著科技水平的發(fā)展，一些新興技術(shù)也不斷涌現(xiàn)。如RNAi的技術(shù)也被應(yīng)用于蜜蜂微孢子蟲的研究中，2010年，基于N.ceranaeADP/ATP transporter基因設(shè)計(jì)的dsRNA，經(jīng)口飼喂后，顯示了抑制效果，為防治蜜蜂微孢子蟲，乃至其他動(dòng)物微孢子蟲病帶來了新的曙光（Paldiet al.，2010）。也許在不久的將來，人們能找到更為經(jīng)濟(jì)、安全而有效的方式防治微孢子蟲病。

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