抗菌肽對蜜蜂細菌性病原的抑菌作用研究

沈克飛 翟少欽 曹 蘭 楊 柳 張邑帆

（重慶市畜牧科學院，榮昌 402460）

囊狀幼蟲病是中蜂的重要疾病，造成嚴重且典型的臨床癥狀，威脅幼蟲發育和蜂群群勢，甚至導致蜂群飛逃。中蜂囊狀幼蟲病最早于1972年發生于廣東省，隨后迅速蔓延到全國和東南亞的中蜂飼養國家和地區。在1972年至1976年的該病流行期間，中國境內飼養中蜂損失超過百萬群。后來疾病的損耗降低，但蜂群的發病率仍在50%～70%。

引發蜜蜂囊狀幼蟲病（Sacbrood）的病原是蜜蜂囊狀幼蟲病病毒（Sacbrood virus，SBV），感染中蜂的SBV常被稱為中蜂囊狀幼蟲病病毒（Chinese sacbrood virus，CSBV）。SBV為正鏈單股RNA病毒，屬于昆蟲小RNA樣病毒（Picorna-like virus），被劃入傳染性軟化病病毒屬（Ifl avirus）。該病毒基因組除去Poly A尾大約含有8830個堿基，只有1個大的開放閱讀框架（Open Reading Frame），編碼大約2860個氨基酸殘基的多聚蛋白（Polyprotein）。在病毒自身編碼的蛋白酶的作用下，多聚蛋白氨基端剪切、加工產生成熟的結構蛋白，羧基端剪切、加工產生為非結構蛋白。目前，對蜜蜂病毒性病原的研究主要集中在病原檢測及系統進化分析，很少涉入病毒的分離培養。病毒的雞胚培養法是應用于病毒病的診斷、預防和防治方面的有效手段，也是研究病毒生物學特性的途徑之一。本實驗開展了CSBV雞胚培養方法的嘗試，以期提供簡便的CSBV體外培養方法。

1 材料與方法

1.1 樣本

采自重慶地區暴發囊狀幼蟲病的中蜂場，具有典型囊狀幼蟲病特征，經RT-PCR法鑒定為SBV陽性[1]，于-80 ℃保存。

1.2 主要試劑

rTaq DNA聚合酶、pMD18-T載體、Trizol和PrimeScript RT-PCR Kit均購自TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒購自OMEGA 公司。CSBV部分結構蛋白抗血清由重慶市畜牧科學院獸醫研究所制備并保存[2]。

1.3 病毒分離

病死中蜂幼蟲及其滲出液與生理鹽水按1：10比例加入，于研磨器中研磨5 min，5 000 r/min離心10 min，收集上清，加入終濃度1000 單位雙抗，37 ℃孵育30 min后，經尿囊腔接種活力旺盛的9日齡雞胚5枚，0.2 mL/枚，37 ℃培養。同時設正常雞胚對照。無菌收集尿囊液，并盲傳5代。

1.4 分子病毒學鑒定

1.4.1 引物設計

根據CSBV廣州株基因組序列（GenBank登錄號：AF469603）設計擴增CSBV-CQ編碼序列的引物。引物由生工生物工（上海）有限公司合成。引物序列見表1。

1.4.2 總RNA的提取

表1 用于CSBV RT-PCR擴增的引物

取3 00 μL尿囊液加入7 00 μL Trizol混勻，室溫靜置15 min后，加入250 μl氯仿，充分振蕩后室溫靜置15 min；加入250 μl氯仿充分振蕩后靜置15 min；4℃，12 000 r/mim離心15 min；取上清，加入等體積的異丙醇，混勻后于-20 ℃靜置1 h；4℃，12 000 r/min離心10 min。沉淀用70%的乙醇洗滌一次，吸干上清，沉淀溶解于100 μl經DEPC處理的去離子水中，以備反轉錄。

1.4.3 RT-PCR法病毒檢測

使用PrimeScript RT-PCR Kit及其Random 6mers，以提取的尿囊液總RNA為模板反轉錄合成cDNA第一條鏈，實驗操作按試劑盒說明書進行。以反轉錄合成的cDNA為模板PCR擴增CSBV-CQ編碼序列。PCR反應體系為：10×PCR Buffer（含15 mM Mg2+）2.5 μl，2.5 mM dNTPs 0.5 μl，5 U/μl rTaq 0.1 μl，10 μM的上、下游引物各0.5 μl，cDNA 0.5 μl，補去離子水至25 μl。反應條件為：94℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個循環；72 ℃再延伸5 min。所用引物見表1。

1.4.4 條帶與序列分析

PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收目的條帶，將其克隆至pMD18-T載體，用質粒上的通用引物M13+/ M13-進行雙向序列測定，將所得序列在NCBI上作BLAST搜索以進行同源性分析。

1.5 免疫印跡分析

CSBV感染致死幼蟲樣本和接種CSBV尿囊液分別經10% SDS-PAGE分離后轉印NC膜，用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h；TBST洗滌3次；加入CSBV抗血清（1：1000稀釋），室溫孵育1 h；TBST洗滌3次；再加入堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠IgG（1：5 000稀釋），室溫孵育1 h；TBST洗滌3次；置BCTP/NBT顯色液中顯色。

2 結果

2.1 雞胚接種

CSBV第一次接種9日齡雞胚尿囊腔后，在前4天孵化期間雞胚未死亡，發育速度正常，胚體無明顯出血點，肝臟有出血點。正常對照胚體及肝臟無出血點。連續盲傳5代，雞胚無死亡，現象同第一次接種。

2.2 病毒RT-PCR鑒定結果

RT-PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，可見使用CSBV特異的引物從接種雞胚尿囊液提取的總RNA中擴增出清晰、特異、大小與預期相符的條帶（圖1），而未接種雞胚未擴增出條帶。5次盲傳尿囊液均擴增出相同條帶圖譜。經序列測定及序列分析得出，所擴增片段是SBV基因片段，片段拼接后獲得一條長度約占SBV基因組90%的片段，與CSBV-CQ分離株（GenBank登錄號：KC285046）同源性（高于99.5%）高于其他分離株。

圖1 RT-PCR擴增結果 M：DNA marker DL2000；1-9：分別為引物SB1F/SB1R-SB9F/SB9R的產物

2.3 免疫印跡分析

CSBV抗血清與CSBV 感染致死幼蟲樣本和CSBV接種雞胚尿囊液強烈反應而產生一條特異條帶，但接種雞胚尿囊液CSBV滴度不及感染致死幼蟲樣本CSBV滴度，接種雞胚尿囊液稀釋2倍后特異條帶亮度極弱；未接種雞胚尿囊液無任何條帶出現（圖2）。

3 討論

圖2 免疫印跡結果

囊狀幼蟲病正困擾著中蜂產業的發展，其危害日益受重視。病原分離培養是進行病原學研究的基礎。賴德真等于1982年報道了用雞胚組織培養囊狀幼蟲病病毒[3]。本實驗將囊狀幼蟲病致死的中蜂幼蟲懸液接種9日齡雞胚，盲傳5代均可見雞胚肝臟有出血點，用RT-PCR法從接種尿囊液中擴增出了CSBV的基因組片段，運用免疫印跡法檢測到接種雞胚尿囊液存在CSBV顆粒，表明CSBV在雞胚尿囊腔中可增殖。但接種雞胚尿囊液免疫印跡條帶亮度不及病死幼蟲樣本條帶亮度，顯示尿囊液中的病毒滴度較低。目前，SBV的體外培養主要依靠不能傳代的蜜蜂中腸細胞[4]，該細胞的培養需要極高的專業技能，而本實驗為CSBV提供了簡便的培養法，為進一步開展CSBV病原學和分子遺傳學研究奠定了物質基礎。

在自然感染中，SBV容易發生遺傳變異，導致病毒的致病性、細胞嗜性、生物學特性等發生較大改變。依據系統進化分析可將感染西方蜜蜂和東方蜜蜂的SBV總體上分為歐洲基因型和亞洲基因型病毒，亞洲的西方蜜蜂蜂群中存在2個基因型病毒，而東方蜜蜂體中存在2個基因型基因片段[5-10]。研究指出，SBV具有型特異的遺傳變異特性[10]，也同其它小RNA病毒一樣基因型間存在基因重組，這給適應新的蜜蜂種類提供遺傳學基礎和條件。

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