日本蟾蜍皮膚胸腺素α 原cDNA 的克隆及序列分析

宋敏國， 袁進強， 楊仙玉， 張姝芳， 諸葛慧， 徐 躍

（浙江農林大學 農業與食品科學學院， 浙江 臨安311300）

胸腺素α 原（prothymosin α， ProTα）是一種在哺乳動物細胞中廣泛分布、 結構保守的酸性小分子蛋白， 是胸腺素α1（thymosin α1， Tα1）的前體蛋白［1］。 胸腺素α 原在抗腫瘤方面具有顯著的作用， 如可降低鼠的膀胱癌發生率［2］， 抑制HeLa 細胞凋亡， 誘導巨噬細胞產生干擾素和白介素等［3］。 鑒于蟾酥、 蟾衣、 蟾皮等中藥材廣泛應用于臨床抗腫瘤治療［4－5］， 本研究開展以日本蟾蜍Bufo japonicus formosus 皮膚cDNA 質粒文庫為模板， 通過菌落聚合酶鏈式反應（colony polymerase chain reaction， colony PCR）篩選具有完整開放閱讀框（open reading frame， ORF）的全長cDNA 的工作。 本研究篩選到日本蟾蜍ProTα 全長cDNA 序列， 并運用多種軟件對其編碼的蛋白質進行了生物信息學分析， 構建系統進化樹， 為進一步研究日本蟾蜍ProTα 蛋白的功能及其藥物研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

日本蟾蜍皮膚cDNA 質粒文庫通過材料轉讓協議， 由日本產業技術總合研究所（AIST， Tsu-kuba， Japan）授權浙江農林大學使用（作者楊仙玉在日本AIST 博士后工作期間制備）。 該文庫使用的載體為pSD64TR，上游和下游克隆位點分別為EcoR I 和Xho I， 載體上游和下游引物為SP6（5′-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3′）和S.D.A.（5′-TTATGTAGCTTAGAGACTC-3′）， cDNA 的長度介于500～2 000 bp。

大腸埃希菌Escherichia coli 感受態細胞DH5α， PCR 反應試劑盒， 2×PCR 混合試劑（master mix）等購自天根生化科技有限公司， DNA 梯狀核酸片段（ladder）和質粒小量抽提試劑盒購自碧云天生物技術研究所。 引物合成與DNA 測序委托上海生工生物技術有限公司或上海桑尼生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 日本蟾蜍皮膚cDNA 質粒文庫轉化 將cDNA 質粒文庫0.2 μL 電擊轉化到E. coli DH5α 感受態細胞中（40.0 μL）， 然后迅速加入37 ℃預熱的160.0 μL LB 培養液， 37 ℃恒溫振蕩復蘇45 min， 取2.0 μL 轉化液均勻涂布于LB 平板（含Amp+100 mg·L－1）， 并在37 ℃恒溫培養12～15 h。

1.2.2 全長cDNA 篩選 從平板上隨機挑取單菌落接種于10.0 μL 的LB 液體培養基中， 以此菌液為模板實施菌落聚合酶鏈式反應。 使用的引物是載體上游引物SP6 和自行設計的含ploy（T）的cDNA 下游引物（5′-AGATCTCTCGAGTTTTTTTTTTTT-3′）。 反應體系如下： 菌液0.5 μL， 2×PCR master mix 5.0 μL， SP6和ploy（T）引物（2 μmol·L－1）各1.0 μL， 補加滅菌超純水至10.0 μL。 為了防止聚合酶鏈式反應期間的水分蒸發， 在反應體系中補加礦物油10.0 μL。 反應條件為： 94 ℃/5 min， （94 ℃/30 s， 50 ℃/30 s， 72 ℃/120 s）×30 循環， 72 ℃/8 min， 4 ℃/∞。 聚合酶鏈式反應結束后， 取5.0 μL PCR 產物經10.0 g·kg－1瓊脂糖凝膠電泳分析， 將擴增出介于500～2 000 bp 聚合酶鏈式反應產物的菌落初步確定為陽性。

1.2.3 質粒回收和DNA 測序 將通過菌落聚合酶鏈式反應初步確定為陽性克隆的菌液0.2 μL 接種于3.5 mL LB 培養液中（含Amp+100 mg·L－1）， 在37 ℃恒溫振蕩培養12～15 h， 然后使用試劑盒進行質粒回收并對其進行DNA 限制性內切酶（EcoR I 和Xho I）消化（雙酶切）， 進一步確定陽性克隆及質粒濃度。 首先委托公司將陽性克隆質粒使用載體上游引物（SP6）對cDNA 進行正向測序。 測序結果利用DNAstar/EditSeq 查找cDNA 的完整開放閱讀框， 推導氨基酸序列， 對具有合理完整開放閱讀框的克隆繼續委托公司使用載體下游引物（S.D.A.）進行反向測序。

1.2.4 序列分析 利用DNAstar/EditSeq 尋找完整開放閱讀框， 推導其編碼蛋白的氨基酸序列并分析其理化性質， 運用NCBI 的Blast 功能在GenBank 中查找并下載其他物種同源蛋白的氨基酸序列， 運用MegAlign 7.1 軟件進行同源性比較， 并構建系統進化樹。

2 結果

2.1 cDNA 的篩選

將日本蟾蜍皮膚cDNA 質粒文庫轉化E. coli 感受態細胞DH5α 獲得的菌落， 以SP6 和ploy（T）為引物， 實施菌落聚合酶鏈式反應。 10 g·kg－1瓊脂糖凝膠電泳分析顯示， 在1 500 bp 左右出現一特異性聚合酶鏈式反應條帶（圖1A， 箭頭所示）， 在500 bp 左右出現一非特異性聚合酶鏈式反應條帶。 將此菌液進行擴大培養和質粒回收， 并對質粒進行EcoR I 和Xho I 雙酶切和10 g·kg－1瓊脂糖凝膠電泳檢測， 結果顯示該質粒含有1 500 bp 左右的cDNA（圖1B， 箭頭所示）， 與菌落聚合酶鏈式反應的結果吻合。 將此質粒委托DNA 測序公司進行了正、 反雙向測序。

2.2 序列分析

2.2.1 測序結果分析及其編碼蛋白的理化性質 使用DNAstar/EditSeq 對測序結果進行分析， 表明該cDNA 全長1 480 bp， ORF 為339 bp， 5′ 端125 bp 及3′ 端1 016 bp 的非翻譯區。 完整開放閱讀框中三磷酸腺嘌呤脫氧核糖核苷和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核糖核苷（A+T）的質分數為53.10%， 三磷酸鳥嘌呤脫氧核糖核苷和三磷酸胞嘧啶脫氧核糖核苷（G+C）的質量分數為46.90%， 共編碼112個氨基酸（圖2）， 其中酸性氨基酸（D+E）55 個，大部分成簇集中于序列中部， 堿性氨基酸（R+K）13 個， 極性氨基酸（N， C， Q， S， T， Y）16個， 疏水性氨基酸18 個， 缺乏芳香族氨基酸和含硫氨基酸。 其等電點（PI）理論值為3.554， 蛋白質分子質量為12.345 kD， 是一種高度酸性的親水性多肽。 同源性比較發現， 該cDNA 編碼的蛋白與其他物種的ProTα 具有較高的同源性，故命名為日本蟾蜍ProTα。

圖1 pSD64TR-ProTα 菌落聚合酶鏈式反應產物（A）和重組質粒EcoRⅠ和Xho I 雙酶切（B）產物的瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 Agarose gel electrophoresis of colony PCR product （A）and enzyme digestion product of recombinant plasmid of pSD64TR-ProTα

圖2 日本蟾蜍ProTα 全長cDNA 序列及其ORF 編碼的氨基酸推導序列Figure 2 Full length cDNA of ProTα and its deduced amino acid sequence of Bufo japonicus formosus

2.2.2 氨基酸序列同源性分析和系統進化樹構建 將日本蟾蜍ProTα 氨基酸序列和美國國家生物技術信息中心（NCBI）網站上的其他物種的ProTα 氨基酸序列進行同源性比較。 結果顯示， 與食用蛙Rana esculenta 同源性高達82%， 與牛Bos taurus， 狨猴Callithrix jacchus， 智人Homo sapiens， 恒河獼猴Macaca mulatta， 小鼠Mus musculus， 穴兔Oryctolagus cuniculus， 黑猩猩Pan troglodytes， 食蟹猴Macaca fascicularis， 褐家鼠Rattus norvegicus， 大西洋鮭Salmo salar， 非洲爪蟾Xenopus laevis 等11 種動物的同源性為54%～73%（圖3）。 通過MegAlign 7.1 軟件鄰接法進行不同物種的氨基酸序列比對以及構建系統進化樹。9 種哺乳類動物分屬1 支， 日本蟾蜍和食用蛙等兩棲類分屬1 支， 大西洋鮭分屬1 支（圖4）。 整個進化樹表明： ProTα 的進化史遵循傳統動物進化規律。

3 討論

圖3 不同物種間ProTα 氨基酸序列比對Figure 3 Multiple alignment of ProTα amino acid sequences among different species

圖4 日本蟾蜍與其他物種ProTα 的系統進化樹Figure 4 Phylogenetic tree of ProTα among different species

本實驗成功克隆到日本蟾蜍ProTα 的全長cDNA（圖1～2）， 編碼112 個氨基酸殘基組成的蛋白， 其中酸性氨基酸（D+E）55 個， 其等電點（PI）理論值為3.554， 甚至在中性pH 的溶液中也帶有大量負電荷，被認為是真核生物中酸性最強的肽類之一［1］。 由于大量酸性氨基酸主要集中在其序列中部， 使得Pro-Tα不能形成高級結構， 在生理條件下蛋白呈現無規則卷曲構象， 即所謂的 “天然無結構蛋白”［6－7］。 中部序列能和組蛋白H1 特異性相互作用， 是促進細胞增殖的主要功能域［8－9］。 ProTα 缺乏含硫氨基酸和芳香族氨基酸， 不能在波長280 nm 處形成吸收峰［1］； 缺乏疏水性氨基酸， 不可能形成信號肽結構， 也就不能以限定途徑分泌到胞外［1］。 現已明確ProTα 在細胞外具有抗腫瘤功能及其他免疫刺激功能， 但它如何分泌到胞外， 至今尚不明確， 有待進一步深入研究。

ProTα 有2 個方面功能： 一是胞內促進細胞增殖。 ProTα 在肝癌、 乳癌、 結腸癌和胃癌細胞中高表達， 表明ProTα 與腫瘤細胞的增殖密切相關［10－13］。 這可能是由于在細胞周期中， ProTα 的高表達縮短了G1 期［14］。 二是胞外具有免疫刺激活性。 ProTα 在細胞外， 通過潛在的膜受體調節免疫應答， 促進IFN-y，TNF-α， IL-2 等細胞因子的產生， 進而增強細胞和體液免疫應答， 從而產生抗腫瘤作用［1］。 另外ProTα作為免疫佐劑， 在小鼠體內能夠維持較高的抗體滴度， 延長免疫保護的時間［15］。 最近有報道， CD8+ T細胞中的ProTα 能夠強烈抑制HIV-1［16］。

ProTα 已作為一種新型的抗瘤藥物進人到臨床前期的研究階段［17］。 因此， 構建合適的含ProTα 全長開放閱讀框（ORF）的表達載體， 大量生產ProTα 蛋白， 對今后ProTα 生物學功能的進一步研究具有參考意義。

［1］ 楊曉征， 吳軍， 熊凌霜. 胸腺素α 原的研究進展［J］. 生物技術通訊， 2006， 17 （3）： 443－446.YANG Xiaozheng， WU Jun， XIONG Lingshuang.Advances in research on prothymosin alpha ［J］.Lett Biotech， 2006， 17（3）： 443－446.

［2］ GOYA R G， BOLOGNANI F.Homeostasis， thymic hormones and aging ［J］.Gerontology， 1999， 45 （2）： 174－178.

［3］ MOODY T， FAGARASAN M， ZIA F， et al. Thymosin alpha 1 down regulates the growth of human non-small cell lung cancer cells in vitro and in vivo ［J］. Cancer Res， 1993， 53 （21）： 5214－5218.

［4］ 張飛春， 孫文革， 高曉玲， 等. 蟾酥乙醇提取物抗腫瘤劑量效應關系實驗研究［J］. 中國藥業， 2011， 20 （16）：23－24.ZHANG Feichun， SUN Wenge， GAO Xiaoling， et al. Experimental studies of the relationship between dose-dependency of ethanol extract of toad venom and antitumor effects ［J］. J Chin Pharm， 2011， 20 （16）： 23－24.

［5］ 繆珠雷， 張康， 楊鳴澤， 等. 蟾蛻抗腫瘤及增強免疫效應研究［J］. 中國中藥雜志， 2010， 25 （2）： 211－214.MIAO Zhulei， ZHANG Kang， YANG Mingze， et al. Studies on anti-tumor and enhancing immunity activity of toad coat ［J］. Chin J Chin Mater Med， 2010， 25 （2）： 211－214.

［6］ 劉俊珊， 張冬梅， 栗原博， 等. 蟾酥及其活性成分抗腫瘤作用研究進展［J］. 國際藥學研究雜志， 2009， 36 （2）：115－120.LIU Junshan， ZHANG Dongmei， KURIHARA Hiroshi， et al. Antitumor effects of venenum bufonis and its active components ［J］. J Int Pharm Res， 2009， 36 （2）： 115－120.

［7］ GAST K， DAMASCHUN H， ECKERT K， et al. Prothymosin alpha： a biologically active protein with random coil conformation ［J］. Biochem， 1995， 34 （40）： 13211－13218.

［8］ COVELO G， SARANDESES C S， DíAZ-JULLIEN C， et al. Prothymosin alpha interacts with free core histones in the nucleus of dividing cells ［J］. J Biochem， 2006， 140 （5）： 627－637.

［9］ WILSON C L， MONTEITH W B， DANELL A S， et al. Purification and characterization of the central segment of prothymosin alpha： methodology for handling highly acidic peptides ［J］. Pept Sci， 2006， 12 （11）： 721－725.

［10］ WU C G， HABIB N A， MITRY R R， et al. Overexpression of hepatic prothymosin alpha， a novel marker for human hepatocellular carcinoma ［J］. Br J Cancer， 1997， 76 （9）： 1199－1204.

［11］ MAGDALENA C， DOMINGUEZ F， LOIDI L， et al. Tumour prothymosin alpha content， a potential prognostic marker for primary breast cancer ［J］. Br J Cancer， 2000， 82 （3）： 584－590.

［12］ SHIWA M， NISHIMURA Y， WAKATABE R， et al. Rapid discovery and identification of a tissue-specific tumor biomarker from 39 human cancer cell lines using the SELDI ProteinChip platform ［J］. Biochem Biophys Res Commun，2003， 309 （1）： 18－25.

［13］ 王梅， 潘吉勇， 安利佳. 胸腺素α 原反義寡核苷酸對胃癌細胞生長的影響［J］. 現代生物醫學進展， 2009， 9（11）： 2051－2054.WANG Mei， PAN Jiyong， AN Lijia. Effect of prothymosin alpaha antisense oligodeoxynucleotide on human gastric cancer in vitro ［J］. Prog Mod Biomed， 2009， 9 （11）： 2051 - 2054.

［14］ WU Chaoliang， SHIAU Aili， LIN Cheinsheng. Prothymosin α promotes cell proliferation in NIH3T3 cells ［J］. Life Sci， 1997， 61 （21）： 2091－2101.

［15］ 靳彥文， 陳婷， 李平， 等. 胸腺素α 原作為乙型肝炎表面抗原佐劑的研究［J］. 生物技術通訊， 2008， 19 （4）：497－499.JIN Yanwen， CHEN Ting， LI Ping， et al. Study of prothymosin alpha as adjuvant to HbsAg ［J］. Lett Biotechnol，2008， 19 （4）： 497－499.

［16］ MOSOIAN A， TEIXEIRA A， BURNS C S， et al. Prothymosin-α inhibits HIV-1 via Toll-like receptor 4 mediated type I interferon induction ［J］. PNAS， 2010， 107 （22）： 10178－10183.

［17］ ECKERT K， GRUNBERG E， GARBIN F， et al. Preclinical studies with prothymosin alpha 1 on mononuclear cells from tumor patients ［J］. J Immunopharmacol， 1997， 19 （9－10）： 493－500.