豬日本乙型腦炎病毒NS1基因的表達和抗體制備

沈紅霞，韓秀杰，趙凡凡，張保新，余風艷，王曉杜

(浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 臨安 311300)

乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，又稱日本腦炎病毒，可引起以中樞神經系統損害為主的蟲媒性人畜共患病，即乙型腦炎或日本腦炎。中國乙腦發病人數占世界總發病數的80%以上[1]。JEV可以感染蚊子Culicidae和豬Sus scrofa domesticus，作為JEV的寄存宿主，豬感染乙腦病毒后表現為繁殖機能障礙，母豬表現為產死胎、木乃伊胎等。該病不僅嚴重影響養豬業的健康發展，也是獸醫公共衛生重點關注的疾病之一。JEV屬黃病毒科Flaviviridae黃病毒屬Flavivirus，其基因組為單股、正鏈RNA分子，其長度約為11 kb(10 976 bp)，從5′端96位ATG起始，至3′端10 393位終止，僅形成1個長約10.3 kb的開放讀碼框架 (ORF)，編碼1個長為3 432個氨基酸殘基的蛋白前體，在宿主細胞內蛋白酶和病毒蛋白酶的切割下，它產生3種結構蛋白(C蛋白、PrM/M和E蛋白)以及7種非結構蛋白 (NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b 和 NS5)[2－3]。該病毒經過幾十年的進化，現存 5 種基因型，整個亞洲JEV的各種基因型都有流行[4]。其中JEV-NS1基因全長約1 245 bp，預測分子量為40 kDa左右，由于N端存在糖基化位點，所以在病毒感染細胞中是分子量為46 kDa的糖蛋白[5]。前體蛋白首先在E-NS1位點裂解后，NS1轉位到內質網膜上，然后NS1～NS2a位點發生裂解，產生成熟的NS1[6]。NS1的主要功能是作為病毒RNA復制的共因子，參與病毒RNA的合成。與此同時，因它能分泌到胞外，激發機體產生針對NS1的抗體，而此抗體能抵抗病毒的感染[7]，所以NS1也與E和M蛋白一樣，作為疫苗開發的對象得到廣泛研究。本研究克隆豬日本乙型腦炎的NS1基因，構建重組原核表達載體，在大腸埃希菌Escherichia coli中大量表達，并純化該重組蛋白，制備小鼠抗JEV-NS1的抗體，驗證抗體的特異性，為探討該蛋白的功能及病毒復制的相關研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

豬日本乙型腦炎病毒SH-JEV01毒株由中國農業科學院上海獸醫研究所馬志永研究員惠贈；BHK-21細胞，原核表達載體pET-28(a)、大腸埃希菌感受態細胞DH5α和BL21(DE3)為浙江農林大學獸醫微生物學實驗室保存。ICR小鼠Mus musculus購于浙江省醫科院實驗動物中心。

核酸標準(DNA marker DL2000)，限制性內切酶EcoRⅠ和SalⅠ，AMV反轉錄試劑盒，Taq DNA聚合酶等購自大連寶生物公司；T4 DNA ligase購于NEB公司；IPTG和弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購于Sigma公司；Trizol購自invitrogen公司；DNA膠回收試劑盒購于上海華舜生物公司；A型小量DNA片段快速純化回收試劑盒，質粒DNA小量提取試劑盒購于axgen生物有限公司。其他試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因組RNA的提取 將JEV病毒感染的BHK-21細胞樣品重懸于Trizol試劑中，室溫10 min后，加入1/3體積氯仿，反復混勻后室溫5 min。以15 000°min－1離心15 min，吸取上清液轉移至另一離心管中，加入等體積的異丙醇，反復混勻后室溫沉淀5 min，以15 000°min－1離心15 min。去掉上清液后，用70%的乙醇洗滌沉淀1次，室溫干燥后，溶于適量的RNase free水中，－20℃儲存備用。

1.2.2 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增JEV-NS1基因 根據AMV反轉錄試劑盒說明書上的方法，將上面提取的病毒基因組RNA，利用隨機引物反轉錄合成cDNA。以此cDNA為模板，JEV-NS1引物上游 F: 5′gcggaattcatggacactggatgtg 3′； JEV-NS1 全長片段下游引物 R1: 5′gcggtcgacttaggcagcgactagc 3′(1～1 254 bp)，JEV-NS1 突變體下游引物 R2: 5′gcggtcgacttacggaagggagcaactg 3′(1～957 bp)，在 PCR 管中加入如下 20 μL 體系: RNAse Free ddH2O 14.3 μL，10×緩沖液 2.0 μL，dNTPs 1.6 μL，10 μmol°L－1引物各0.4 μL，Taq酶0.3 μL，cDNA模板 1.0 μL；在PCR儀中以下面條件進行PCR擴增: 94℃預變性5 min；94℃變性50 s，58℃退火50 s，72℃延伸2 min，共35個循環；循環結束后72℃延伸10 min，最后4℃保存。10.0g°L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

1.2.3 pET-28(a)-JEV-NS1重組質粒構建 將上述膠回收的JEV-NS1的PCR產物和pET-28(a)空質粒使用EcoRⅠ，SalⅠ分別進行雙酶切，酶切回收后，回收產物在T4連接酶作用下，把JEV-NS1全長和突變體亞克隆到pET-28(a)載體上，轉化大腸埃希菌DH5α，挑取菌落經PCR和重組質粒雙酶酶切鑒定為陽性者，送上海英駿生物公司測序鑒定。

1.2.4 重組蛋白JEV-NS1的誘導表達 上述陽性重組質粒pET-28(a)-JEV-NS1和 pET-28(a)-JEV-NS1-mutant轉化到大腸埃希菌BL21(DE3)內，挑取克隆擴大培養，細菌生長到對數期時加入1.0mmol°L－1的IPTG誘導，培養3 h后，取樣并煮沸制備樣品，SDS-PAGE檢測重組JEV-NS1和JEV-NS1-mutant蛋白表達情況。

1.2.5 重組蛋白JEV-NS1的純化 將1.2.4鑒定好的表達JEV-NS1蛋白的陽性克隆擴大到100.0 mL進行培養，當細菌生長到對數期時，加入1.0 mmol°L－1的IPTG，誘導表達3 h后，收集菌體，按照王曉杜等[8]方法提取包涵體，溶解好的包涵體按照his-band Ni＋試劑盒說明書方法進行純化，純化后蛋白利用透析的方法進行復性，制備大量可溶性的重組JEV-NS1蛋白。聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測該蛋白包涵體提取和純化效果。

1.2.6 多克隆抗體的制備 將純化后的JEV-NS1蛋白與弗氏完全佐劑佐劑混合均勻(1:1)，頸部皮下注射給ICR小鼠(50 μg°只－1)，2周后用弗氏不完全佐劑與蛋白混合后注射，以后隔2周注射1次，共免疫4次后采血，收集血清即為多克隆抗體。用酶聯免疫吸附測定(ELISA)方法測定其效價。

1.2.7 抗體特異性檢測 根據王曉杜[9]的方法，分別以原核表達產物和病毒感染后Vero細胞的裂解產物作為上樣樣品，進行SDS-PAGE，再以制備的小鼠抗JEV-NS1多克隆抗體作為一抗，western-blotting顯色，驗證抗體的特異性。

2 結果與分析

2.1 JEV-NS1基因RT-PCR結果

以1.2.2合成的JEV cDNA為模板，用帶有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點的引物，RT-PCR擴增JEV-NS1的基因片段，所克隆的片段帶有起始密碼子ATG和終止密碼子TAA。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明(圖1)，本研究獲得大小1.3 kb左右的片段，與預期大小基本一致。

2.2 重組質粒pET-28(a)-JEV-NS1的構建

用EcoRⅠ和SalⅠ酶分別對JEV-NS1基因的PCR產物、pET-28(a)空載體進行雙酶切，酶切產物經純化試劑盒純化回收后，JEV-NS1基因的PCR產物、pET-28(a)空載體經T4連接酶連接，連接產物轉化大腸埃希菌DH5α，經菌落PCR鑒定為陽性的克隆，過夜培養后提取質粒，所獲得的重組質粒再進一步用EcoRⅠ和SalⅠ進行雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳，結果(圖2)為陽性的細菌克隆送上海桑尼生物公司測序。測序結果獲得的序列，經美國國家生物技術信息中心(NCBI)上Blast比對，該片段與NCBI上公布的JEV-NS1基因序列同源性高達99%(GenBank No:AF315119)，說明本研究克隆到了JEV-NS1基因，并且該序列正確插入到pET-28(a)空載體，重組表達載體pET-28(a)-JEV-NS1構建成功。

2.3 重組JEV-NS1蛋白的誘導表達

上述鑒定好的pET-28(a)-JEV-NS1重組表達質粒轉化大腸埃希氏菌BL21(DE3)，挑取2～3個克隆過夜培養，重新轉接培養至對數生長期后，1 mmol°L－1IPTG誘導3 h，在異丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導前和誘導后分別取樣，加入1×十二烷基磺酸鈉(SDS)上樣緩沖液，煮沸裂解細菌，SDSPAGE電泳檢測重組蛋白表達情況。結果表明:重組蛋白JEV-NS1在大腸埃希菌內大量表達(圖3)，利用DNASTAR軟件分析，預期分子量大小為(40＋8)kDa，結果表明表達蛋白大小與預期一致(48 kDa左右)。薄層掃描分析表明，表達的重組蛋白占總菌體蛋白的20%以上。利用his-band Ni＋柱純化，只能得到很少的蛋白，不能用于進行下一步實驗。

2.4 JEV-NS1-mutant重組蛋白的表達和純化

根據網站預測(http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/)發現JEV-NS1基因序列中大腸埃希菌稀有密碼子有20個，特別是從958 bp開始有連續3個稀有密碼子，這將限制該基因在大腸埃希菌中的表達，所以重新設計下游引物，按照1.2.3方法構建重組pET-28(a)-JEV-NS1-mutant(958～1 245 bp截短)質粒(圖4)。重組pET-28(a)-JEV-NS1-mutant質粒轉化大腸埃希氏菌BL21(DE3)，經IPTG誘導，SDS-PAGE檢測表明(圖5)，獲得大小為39 kDa左右的重組蛋白(31 kDa＋8 kDa)，JEV-NS1-mutant蛋白表達量明顯上升，表達的重組蛋白占總菌體蛋白的40%以上。經his-band Ni＋純化，獲得高純度的重組JEV-NS1-mutant蛋白，占純化后總蛋白的85%以上。

圖1 JEV-NS1基因的RT-PCR擴增結果Figure 1 Amplification of JEVNS1 by RT-PCR

圖2 pET-28(a)-JEV-NS1 重組質粒的酶切鑒定Figure 2 Digestion ofrecombinant plasmid pET-28 (a)-JEVNS1 by restrict enzyme

圖3 重組JEV-NS1蛋白的誘導表達Figure 3 Expression of recombinant protein JEV-NS1 by IPTG induction

圖4 pET-28(a)-JEV-NS1-mutant重組質粒的構建Figure 4 Construction of recombinant plasmid pET-28(a)-JEV-NS1-mutant

圖5 重組JEV-NS1-mutant蛋白的誘導表達和純化Figure 5 Expression and purification of recombinant protein JEV-NS1-mutant by IPTG induction

2.5 JEV-NS1免疫原性及抗體特異性鑒定

重組JEV-NS1-mutant蛋白免疫ICR小鼠，制備的小鼠抗JEV-NS1多克隆抗體，其ELISA效價為2×105。以原核表達產物(JEV-NS1，JEV-NS1-mutant)進行SDS-PAGE，小鼠抗JEV-NS1作為一抗，westernblotting檢測抗體與抗原的反應性，結果表明:抗體能特異的識別JEV-NS1蛋白和JEV-NS1-mutant蛋白，證明該蛋白具有較好的免疫原性(圖6A)。病毒感染vero細胞12，24，36，48 h后，收取細胞樣品，裂解后進行SDS-PAGE，以本研究制備的小鼠抗JEV-NS1抗體作為一抗，western-blotting檢測抗體與病毒表達JEV-NS1蛋白的反應性，結果表明小鼠抗JEV-NS1抗體能特異識別病毒表達的NS1蛋白(圖6B)。

3 討論

JEV病毒的NS1蛋白在黃病毒科家族中具有較高的保守性，它能激發機體產生中和抗體，是JEV亞單位疫苗的候選者，其DNA疫苗具有較好的免疫保護能力[10]。有較多的學者利用各種不同的表達系統表達該蛋白，一方面可以研究NS1在致病機制中的作用[7]，另一方面可以建立檢測JEV感染的方法[11]。由于抗NS1抗體能通過Fc受體依賴的途徑引發機體的保護性免疫[12]，所以開發出針對NS1的許多單克隆抗體用于治療JEV和黃病毒科病毒的感染[13]。

本研究克隆了從豬群中分離的神經毒JEV病毒株的NS1基因，該序列與美國國家生物技術信息中心上公布序列同源性99%以上，在原核表達系統中大量表達重組蛋白JEV-NS1，表達量達到菌體總蛋白的20%以上，表達量偏低。由于JEV-NS1基因的958 bp后有連續3個稀有密碼子，所以通過突變截短該基因，使得重組蛋白表達量得到極大提高，經純化后達總蛋白的85%以上。利用高純度的重組JEV-NS1-mutant蛋白免疫IRC小鼠，制備了小鼠抗JEV-NS1抗體，抗體效價水平較高，特異性也較好，為檢測JEV試劑盒的建立提供工具，也為研究其病毒誘導的細胞免疫中的作用和探討其在病毒致病中的機理打下較好的基礎。JEV引起的母豬繁殖障礙給養豬業帶來了重大危害，該病在豬群中的發生具有重要的公共衛生學意義，因此，監測該病的流行情況，控制它在豬群中的擴散，研發抗病毒藥物等措施都有利于該病的防控。

圖6 JEV-NS1抗原性和小鼠抗JEV-NS1抗體特異性驗證Figure 6 Immunogenicity of JEV-NS1 and the specificity of mouse anti-JEV-NS1 antibody

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