米力農(nóng)對(duì)兔腦血管痙攣后NO/cAMP信號(hào)通路關(guān)鍵酶的作用研究※

王立君邵正凱牟青春梁紹棟王 闖李金庫(kù)

米力農(nóng)對(duì)兔腦血管痙攣后NO/cAMP信號(hào)通路關(guān)鍵酶的作用研究※

王立君1邵正凱2牟青春1梁紹棟1王 闖1李金庫(kù)1

目的研究米力農(nóng)對(duì)兔蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后腦血管痙攣的作用及潛在機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)通過(guò)枕大池注血建立兔SAH模型。采用CT血管成像（CTA）和經(jīng)顱多普勒超聲（TCD）測(cè)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基底動(dòng)脈的管徑和血流速度，并對(duì)動(dòng)物血漿和腦脊液中一氧化氮（NO）濃度進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果與對(duì)照組相比SAH動(dòng)物的基底動(dòng)脈管徑變細(xì)、血流速度增快，血漿及腦脊液NO濃度降低。同時(shí)，SAH動(dòng)物基底動(dòng)脈eNOS的表達(dá)下降。米力農(nóng)給藥組SAH動(dòng)物平均基底動(dòng)脈管徑增粗而血流速度下降、血漿及腦脊液中NO濃度升高，基底動(dòng)脈eNOS接近對(duì)照組水平，而L-NAME（NOS阻斷劑）可阻斷米力農(nóng)的藥理作用。結(jié)論NO/cAMP信號(hào)通路在下腔出血后腦血管痙攣的發(fā)展中起到重要作用。米力農(nóng)在一定程度上是通過(guò)修復(fù)SAH后受損的NO/cAMP信號(hào)通路起到緩解腦血管痙攣的作用。此外，NO/cAMP信號(hào)通路可做為防治腦血管痙攣的重要靶點(diǎn)。

腦血管痙攣；NO/cAMP信號(hào)通路；蛛網(wǎng)膜下腔出血；米力農(nóng)

研究顯示，30%～70%的動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血（aSAH）患者在出血后會(huì)發(fā)生腦血管痙攣[1]。極易造成腦組織缺血、缺氧，甚至引起腦梗死等嚴(yán)重結(jié)果。本課題以兔SAH模型為基礎(chǔ)，研究米力農(nóng)對(duì)SAH后腦血管的影響作用，及其可能的作用機(jī)制，為研究新藥及新的藥物靶點(diǎn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康普通級(jí)3個(gè)月齡日本大耳白兔32只體質(zhì)量2.3～2.6kg。隨機(jī)分為SAH組、假手術(shù)組、米力農(nóng)組及NOS阻斷劑組，每組8只。

1.2 模型建立采用枕大池二次注血法建立 SAH模型。假手術(shù)組枕大池內(nèi)注入等量等滲鹽水替代自體血。米力農(nóng)組，SAH模型后，耳源靜脈注射米力農(nóng)溶液（魯南制藥集團(tuán)，劑型5mg/5ml）30μg/kg，等滲鹽水稀釋至5ml。米力農(nóng)+N-硝基-左旋精氨酸甲酯（L-NAME）組，造模后，先耳源靜脈注射米力農(nóng)溶液30μg/kg，再注射 L-NAME（30mg/kg，美國(guó)Sigma公司，0.6%/kg），共5ml（等滲鹽水稀釋）。四組均連續(xù)給藥3d，1次/d。

1.3 SAH模型及米力農(nóng)藥效評(píng)價(jià)

1.3.1 經(jīng)顱多普勒超聲（TCD）檢測(cè)基底動(dòng)脈血流速度：于SAH后第3天動(dòng)物處死前，采用德國(guó)Ueberlingen公司TCD儀行腦血流評(píng)價(jià)。

1.3.2 CT血管成像（CTA）檢測(cè)量基底動(dòng)脈管徑：取非注藥側(cè)耳源靜脈穿刺，連接高壓注射器。注入歐乃派克（0.5ml/s，碘含量300mg/ml）。采用最大密度投照技術(shù)（Maximum intensity projection,MIP）重建腦血管圖像。分別測(cè)量基底動(dòng)脈上段、中段和下段三處血管直徑，取三點(diǎn)的平均值做為基底動(dòng)脈管徑。

1.4 檢測(cè)血漿、腦脊液中一氧化氮（NO）濃度利用硝酸還原酶特性將NO3-還原為NO2

-通過(guò)顯色深淺測(cè)定NO濃度高低。取出-80℃保存之備用血漿及腦脊液，室溫下解凍備用。試劑盒由試劑1～7以及10mmol/L標(biāo)準(zhǔn)品（0.5ml）組成。試劑5為過(guò)飽和溶液，由100℃雙蒸水20ml，隔水加熱，玻棒攪動(dòng)充分溶解，避光保存；試劑6加入雙蒸水8ml，避光冷藏保存。配制混合試劑：試劑1和2以1：1濃度配制。配制顯色劑：試劑5：試劑6：試劑7按2.5：1：1濃度配制。配制100μmol/L標(biāo)準(zhǔn)液：取0.1ml標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水定容稀釋至10ml。

標(biāo)本制作：取三個(gè)清潔試管標(biāo)注為空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管，分別加入蒸餾水0.1ml、標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1ml和樣本液0.1ml，均加入0.4ml混合液?；炀?，放入37℃準(zhǔn)確水浴60min，分別向三支試管中再加入試劑3為0.2ml和試劑4為0.1ml。充分渦旋30s，室溫靜置40min，3500～4000轉(zhuǎn)/min，離心10min，取上清液0.5ml，分別加入顯色劑0.6ml?；靹蚝笫覝仂o置10min，蒸餾水調(diào)零，550nm，0.5cm光徑，紫外分光光度計(jì)測(cè)各管吸光度值。按下列公式計(jì)算血漿及腦脊液中NO含量：

NO（μmol/L）=（測(cè)定管吸光度－空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度－空白管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/L）×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各參數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean± SD）表示，計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA）。采用SAS 6.0統(tǒng)計(jì)軟件協(xié)助處理數(shù)據(jù)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在手術(shù)操作及注藥后均得以存活，動(dòng)物在枕大池注血后出現(xiàn)不同程度的萎靡、少動(dòng)但無(wú)神經(jīng)功能缺失。

2.2 基底動(dòng)脈血流速度及管徑變化術(shù)后3天，TCD檢測(cè)顯示，SAH組基底動(dòng)脈平均MFV和PSV均高于假手術(shù)組和米力農(nóng)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；假手術(shù)組與米力農(nóng)組比較MFV和PSV差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而米力農(nóng)＋ L-NAME組MFV和PSV明顯高于假手術(shù)組和米力農(nóng)組，接近于SAH組。

CTA檢測(cè)結(jié)果顯示，SAH組基底動(dòng)脈平均管徑明顯細(xì)于假手術(shù)組和米力農(nóng)組（差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），且可見(jiàn)明顯的串珠樣血管痙攣改變。假手術(shù)組與米力農(nóng)組比較血管管徑差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而米力農(nóng)＋L-NAME組基底動(dòng)脈管徑明顯細(xì)于假手術(shù)組和米力農(nóng)組，接近于SAH組，見(jiàn)表1。

2.3 血漿、腦脊液中一氧化氮(NO)濃度測(cè)定假手術(shù)組動(dòng)物血漿中NO濃度為（74.69±8.05）μmol/L，枕大池注血后動(dòng)物血漿NO平均水平顯著下降，達(dá)到（20.49±2.84）μmol/L，兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。靜脈注射米力農(nóng)后SAH動(dòng)物血漿中NO水平增至（71.75±5.31）μmol/L，與SAH組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而與假手術(shù)組相比P＞0.05。繼續(xù)給予NOS阻斷劑L-NAME后，血漿NO水平下降到（18.28±2.09）μmol/L，與假手術(shù)組和米力農(nóng)治療組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），與SAH組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

假手術(shù)組動(dòng)物腦脊液NO平均濃度為（25.21± 2.81）μmol/L，SAH動(dòng)物腦脊液NO濃度為（16.26 ±1.34）μmol/L，兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。模型動(dòng)物靜脈注射米力農(nóng)，平均腦脊液NO濃度為（23.02±2.09）μmol/L，與SAH組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。模型動(dòng)物在給予米力農(nóng)基礎(chǔ)上，再給予NOS阻斷劑L-NAME，腦脊液平均NO濃度為（13.02±1.83）μmol/L，與前三組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表1 各組大白兔術(shù)后第3天基底動(dòng)脈血流速度及管徑及NO濃度的比較(±s)

表1 各組大白兔術(shù)后第3天基底動(dòng)脈血流速度及管徑及NO濃度的比較(±s)

組別 兔數(shù)(只) MFV (cm/s) PSV (cm/s)基底動(dòng)脈管徑(μm) NO濃度(μmol/L)假手術(shù)組 8 19.4±1.826.7±4.8 1127±14074.69±8.05 SAH組 8 32.7±4.245.2±3.6 772±116 20.49±2.84米力農(nóng)組 8 17.8±1.829.3±3.3 1113±10171.75±5.31米力農(nóng)+ L-NAME組8 33.2±7.243.9±4.1 802±91 18.28±2.09F39.42 26.04 19.41 33.21P＜0.001＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

米力農(nóng)（Milrinone，甲氰吡酮、米力酮）是人工合成的第2代PDEⅢ抑制藥物，化學(xué)名為1,6-二氫-2-甲基-6-氧基-（3,4,-二吡啶）-5-腈。兼有正性肌力作用和血管擴(kuò)張作用（動(dòng)脈和靜脈）。目前，米力農(nóng)廣泛應(yīng)用于治療急性充血性心衰患者[2]。

米力農(nóng)正性肌力作用主要是通過(guò)抑制磷酸二酯酶，血管平滑肌細(xì)胞中的環(huán)磷腺苷含量增加后，激活蛋白激酶使鈣離子外流，鈣離子內(nèi)流受阻，收縮期血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度下降，平滑肌興奮收縮偶聯(lián)過(guò)程受抑制，動(dòng)、靜脈血管擴(kuò)張，故PDEⅢ抑制藥物可通過(guò)調(diào)節(jié)血管胞漿鈣離子的濃度，使血管擴(kuò)張[3]。

Khajavi對(duì)下腔出血的狗模型應(yīng)用米力農(nóng)0.05 mg/kg連續(xù)應(yīng)用8天后行腦血管造影其血管管徑及動(dòng)力學(xué)明顯改善，但具體機(jī)制未明[4]。眾所周知，蛛網(wǎng)膜下腔出血血漿中NO的濃度變化對(duì)腦血管痙攣起著決定性作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在應(yīng)用米力農(nóng)后，蛛網(wǎng)膜下腔出血的兔無(wú)論是血管管徑、血流速度均有所改善，提示米力農(nóng)確實(shí)有改善腦血管痙攣的作用。在米力農(nóng)給藥基礎(chǔ)上繼續(xù)給予L-NAME，而L-NAME是常用的NOS阻斷劑，可有效抑制eNOS活性[5]，故進(jìn)一步提示米力農(nóng)的擴(kuò)血管藥理作用可能與調(diào)節(jié)NOS有關(guān)。

TCD和CTA的檢測(cè)結(jié)果，eNOS功能異常在腦血管痙攣的發(fā)生、發(fā)展中起到積極作用。為明確腦血管痙攣后eNOS功能異常對(duì)下游NO的影響作用，筆者對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血漿及腦脊液中NO進(jìn)行了測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)采用硝酸還原酶法檢測(cè)血漿和腦脊液中NO濃度，與傳統(tǒng)的金屬鎘還原法相比，硝酸還原酶法更加靈敏而穩(wěn)定[6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SAH后血漿及腦脊液中NO濃度顯著下降，與假手術(shù)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明腦血管痙攣時(shí)動(dòng)物體內(nèi)的NO生成減少。米力農(nóng)給藥組動(dòng)物血漿及腦脊液平均NO濃度顯著增高。米力農(nóng)能上調(diào)腦血管痙攣后受損的eNOS表達(dá)，并通過(guò)間接促進(jìn)NO釋放引起腦血管擴(kuò)張。米力農(nóng)給藥后再給予L-NAME則eNOS表達(dá)下調(diào)，同時(shí)NO水平隨之顯著下降，表明L-NAME抑制米力農(nóng)誘導(dǎo)的eNOS表達(dá)繼而抑制NO生成。在NO/cAMP信號(hào)通路中，較高的cAMP水平有助于下游信號(hào)的正常傳遞。因此，無(wú)論是促進(jìn)cAMP生成，還是減少cAMP水解均有助于維持NO介導(dǎo)的內(nèi)皮源性血管舒張作用。多年前即有學(xué)者在痙攣血管局部應(yīng)用罌粟堿，利用其非特異性磷酸二酯酶（PDE）抑制作用減少cAMP降解，取得較好的擴(kuò)血管效果[7]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明米力農(nóng)的腦血管擴(kuò)張作用可能與其調(diào)控NO/cAMP信號(hào)機(jī)制，促進(jìn)NO生成有關(guān)。但米力農(nóng)是如何作用于NO/cAMP信號(hào)的起始關(guān)鍵酶eNOS從而引發(fā)一系列下游事件，這一機(jī)制仍有待闡明。

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R743

A

1673-5846(2013)08-0215-03

1牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院神經(jīng)外科，黑龍江牡丹江 157011

2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，黑龍江哈爾濱 150000

黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題（2011-294）

王立君（1972.1-），男，漢族，山東萊州人，碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：腦血管病的顯微及血管內(nèi)治療。