納米磁珠提取法在手足口病病原RNA提取中的應用

祝儉平，廖禮梅，鄭敏華，王慶元，馬秋林（廣東省東莞市婦幼保健院產前診斷中心 523002）

手足口病（HFMD）是由腸道病毒引起的急性傳染病，引起手足口病的腸道病毒包括腸道病毒71型（EV71）和A組柯薩奇病毒（CA）、埃可病毒（Echo）的某些血清型。實時熒光反轉錄－聚合酶鏈反應（RT－PCR）具有高靈敏度和高特異性，并且快速，是臨床實驗室診斷常用方法。周圍環境中廣泛存在的RNAse（RNA酶）能快速降解RNA，對核酸提取提出更高要求，提取方法越復雜，RNA降解就越多，容易造成假陰性結果。納米磁珠法能夠做到核酸提取過程自動化，減少人為RNAse污染，作者對其和傳統的Trizol抽提法進行對比，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2012年5月本院手足口病高峰期，取門診及住院臨床診斷為手足口病患兒發病7d內的肛拭標本240例，患兒年齡6個月至10歲。

1.2 儀器設備 Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀及上海之江EX2400核酸自動提取儀。

1.3 試劑來源 EV71型和柯薩奇病毒A組16型（CA16）核酸實時熒光RT－PCR檢測試劑盒和Trizol提取試劑均購自中山大學達安基因股份有限公司，納米磁珠RNA提取試劑盒購自上海之江公司。

1.4 RNA提取方法

1.4.1 納米磁珠自動提取法 肛拭標本溶解于適量生理鹽水中，振蕩混勻，備用。取出一塊預裝板，撕開鋁箔，分別加入6 μL RNA助沉劑及200μL標本于預裝板對應的A1－A12孔，將預裝板放入核酸自動提取儀的卡槽內，安裝好磁套，選擇程序“RNA Isolation”運行。運行結束后，棄磁套，于核酸自動提取儀內取出預裝板，E1－E12對應孔中的液體即為提取好的RNA，可直接用于檢測。

1.4.2 Trizol提取法 肛拭標本加入300μL生理鹽水，振蕩洗脫，洗脫液加入Trizol和氯仿，靜置3min，12 000r/min離心5min；樣品即分成水樣層、中間層和有機層，收集水樣層通過SiO2沉淀RNA來還原，離心取沉淀加入75%乙醇液洗滌，離心沉淀，自然干燥，加入30μL DEPC水混勻，待用。

1.5 實時熒光RT－PCR 檢測腸道病毒EV71、CA16特異核酸片段嚴格按試劑說明書操作。

1.6 統計學處理 SPSS12.0軟件對結果進行分析處理，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

240例臨床標本提取EV71和CA16病毒核酸，納米磁珠法檢測EV71陽性率27.5%，CA16陽性率23.3%；Trizol法EV71陽性率26.6%，CA16陽性率22.1%，見表1。經SPSS 12.0統計分析，EV71和CA16兩種方法檢測對比陽性率差異無統計學意義（P＞0.05），顯示納米磁珠提取法可以用于臨床診斷實驗。

表1 兩種RNA提取方法對240例肛拭標本實時熒光RT－PCR檢測結果［n（%）］

3 討 論

手足口病毒屬小RNA病毒科、腸病毒屬，其中最常見為EV71和CA16型。柯薩奇病毒是多種疾病的致病原，不僅可以引起呼吸道感染，還可引起心肌炎、心肌病及神經系統疾病。柯薩奇病毒分為A、B兩大組，A組23個型，B組6個型，能引起手足口病的主要為A組的16型，A組的4、5、9、10型及B組的5型亦可引起該病。新腸道病毒包括4個血清型（68、69、70、71），只有71型可引起手足口病［1］。EV71型常引起重型病例，造成中樞神經系統感染和心肌炎等，臨床出現致死病例，迫切需要對EV71進行快速檢測。臨床常用檢測方法為實時熒光RT－PCR，其具有高度靈敏度和高特異性，與病毒學培養結果一致［2］。核酸提取的原理主要分為3個部分：第一部分是利用裂解液促使細胞破碎，使細胞中的核酸釋放出來；第二部分是把釋放的核酸特異地吸附在特定的載體上，當然這種載體只對核酸有較強的親和力和吸附力，而對其他的生化組分如蛋白質、多糖、脂類則既不親和也不吸附；第三部分是把吸附在特定載體上的核酸洗脫下來，從而得到純化的核酸。現今核酸提取有各種方法，主要是針對第二部分使用特定載體的不同而區分，常見的有Trizol提取法、旋轉離心柱提取法、玻璃粉吸附法、納米磁珠提取法等［3］。其中納米磁珠提取法可應用于全自動核酸提取儀，提取自動化，不但大大降低提取的勞動強度，而且減少了核酸手工提取中容易出現的操作失誤，增加核酸提取的一致性和重復性。

納米磁珠法中使用的磁性微球在1996年開始出現，是將無機磁性粒子與高分子材料結合形成的一種復合微球，是新型功能材料。由于其自身兼具高分子微球和磁性粒子的眾多特性，故無外增加磁場時在溶液中分散均勻、穩定；增加外磁場則可簡單快速分離，可以通過共聚、表面改性賦予其表面多種反應性功能基團，具有良好的生物相容性，使傳統繁重的核酸提取過程變為自動化［4］。目前大多數全自動核酸提取儀都是采用硅吸附法，把二氧化硅等成分吸附到磁珠表面對RNA進行提取。本文對納米磁珠法和Trizol法提取手足口病RNA病毒進行對比，結果兩種方法效果接近，差異無統計學意義。EV71和CA16陽性率用納米磁珠法測定分別為27.5%和23.3%，和廣東省內其他醫院基本相同［5］。

經典的Trizol提取法，提取RNA純度高，缺點是操作較為煩鎖，抽提和沉淀等操作都可能引起RNA的損失。而全自動核酸提取儀法利用磁性顆粒從樣品裂解物中抓獲總RNA，對總RNA的破壞較小，同時自動化核酸提取也避免了交叉污染的可能性［6］。本次實驗中，納米磁珠法有5例檢出陽性，而在Trizol法中為陰性，可能是因為Trizol法核酸提取處理時間較長，操作較為煩鎖，周圍環境中廣泛存在的RNAse（RNA酶）能快速降解RNA，造成標本假陰性結果。在處理大批量標本時，納米磁珠法應用于自動分析儀總耗時少，提取效率高，具有明顯的優勢。

［1］ 倪語星，尚紅.臨床微生物學與檢驗［M］.4版.北京：人民衛生出版社，2009：436－438.

［2］ 李金明，熊德琴，齊曉彤，等.實時熒光定量PCR在手足口病病原體檢測中的應用［J］.實驗與檢驗醫學，2011，29（2）：129－130.

［3］ 李金明.實時熒光PCR技術［M］.北京：人民軍醫出版社，2011：75－80.

［4］ 劉曉紅，布和巴特爾，黃波，等.生物提取用磁性微球的制備及其性能［J］.化學工程師，2010，24（9）：64－66.

［5］ 黃建國，吳立文，駱志輝，等.手足口病腸道病毒EV71和CoxA16感染的檢測分析［J］.實驗與檢驗醫學，2011，29（3）：328－330.

［6］ 傅松哲，倪賢生，夏文，等.3種核酸提取方法檢測甲型H1N1流感病毒的比較［J］.中國熱帶醫學，2010，10（7）：783－785.