全自動(dòng)生化分析儀試劑添加方式對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

林 霞（江蘇省鹽城市射陽(yáng)縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 224300）

對(duì)于續(xù)添同一批次的試劑，目前絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室一般的做法是：要么把瓶?jī)?nèi)剩余試劑丟掉，更換同廠家同批號(hào)新的一瓶；要么把瓶?jī)?nèi)剩余試劑倒進(jìn)新的一瓶里；要么在剩余試劑中再添加一些新試劑［1］。本實(shí)驗(yàn)選擇化學(xué)比色類、酶法類、免疫比濁類等不同類型生化試劑，從各項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果日間變異、監(jiān)測(cè)終止時(shí)結(jié)果偏差等方面，就全自動(dòng)生化分析儀同一批次試劑的3種添加方式對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 人基質(zhì)定值質(zhì)控血清由美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特（Beckman Coulter）公司生產(chǎn)（批號(hào) M774301）；羅氏（Roche）公司生產(chǎn)cfas校準(zhǔn)品（批號(hào)181937）用于丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、肌酐（Cr）、總蛋白（TP）、鈣（Ca）項(xiàng)目校準(zhǔn)；脂蛋白［LP（a）］、載脂蛋白 A1（ApoA1）、超敏C反應(yīng)蛋白（hs－CRP）由原試劑生產(chǎn)廠家各項(xiàng)目試劑盒配套校準(zhǔn)液校準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 儀器為東芝TOSHIBA120全自動(dòng)生化分析儀。試劑采用日本關(guān)東化學(xué)株式會(huì)社生產(chǎn)的ALT和AST試劑；ALP由寧波普瑞生物技術(shù)公司生產(chǎn)；TP試劑由上海榮盛生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；Cr和Ca試劑由上海執(zhí)誠(chéng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；LP（a）、ApoA1、hs－CRP檢測(cè)試劑盒由英國(guó)RANDOX Laboratories有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 本組選擇的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目包含了化學(xué)比色類：堿性苦味酸法Cr、ALP、TP和Ca；酶法類ALT、AST；免疫比濁類LP（a）、ApoA1、hs－CRP等不同反應(yīng)類型。

1.3.2 進(jìn)行儀器的每日維護(hù) 比色杯的檢查，查看清洗液、供水情況，樣品針、試劑針清洗，擦攪拌棒等。

1.3.3 所有實(shí)驗(yàn)參數(shù)均按儀器和試劑盒說(shuō)明書設(shè)置，本實(shí)驗(yàn)試劑嚴(yán)格按照試劑盒質(zhì)量外觀檢查后添加，如發(fā)現(xiàn)工作液色澤改變，有異物出現(xiàn)或混濁，說(shuō)明試劑已經(jīng)變質(zhì)或被污染應(yīng)丟棄［2］。試劑添加量均在試劑瓶口下10mm，以防試劑盤高速運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)飛濺到其他試劑瓶中而影響測(cè)試結(jié)果。

1.3.4 將儀器使用后剩余的少量試劑連瓶丟掉，代之以未開封的同廠家同批號(hào)試劑，為第1組；取一瓶同廠家同批號(hào)的新鮮試劑，將儀器使用剩余的原試劑倒入其中，再放入儀器，為第2組；往儀器使用中原試劑瓶?jī)?nèi)添加同廠家同批號(hào)的新鮮試劑，為第3組。

1.3.5 開始檢測(cè)前，先進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控血清測(cè)定，同時(shí)采用正常值和異常值兩個(gè)濃度，由英國(guó)RANDOX公司生產(chǎn)，637UN和467UE質(zhì)控血清的測(cè)定結(jié)果均在±2s范圍之內(nèi)。

1.3.6 根據(jù)需要，第1個(gè)月按第1種方法添加儀器內(nèi)使用中試劑，第2個(gè)月按第2種方法添加儀器內(nèi)使用中試劑，第3個(gè)月按第3種方法添加儀器內(nèi)使用中試劑。添加試劑后，分別對(duì)以上項(xiàng)目校準(zhǔn)空白后進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)項(xiàng)目質(zhì)控樣本測(cè)定22次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用EXCEL軟件統(tǒng)計(jì)，以監(jiān)測(cè)時(shí)間（d）為橫軸、測(cè)定值為縱軸，繪制3種不同添加試劑方法時(shí)分別測(cè)得各項(xiàng)目結(jié)果的趨勢(shì)圖；統(tǒng)計(jì)各項(xiàng)目的、s和CV；以室內(nèi)質(zhì)控血清定值為靶值，計(jì)算各項(xiàng)目在監(jiān)測(cè)終止時(shí)結(jié)果的偏差；組間比較用方差分析，組間兩兩比較q檢驗(yàn)（SNK法）。本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3種添加試劑方法檢測(cè)質(zhì)控樣本9個(gè)生化項(xiàng)目所得結(jié)果的比較 3種添加試劑方法檢測(cè)9個(gè)生化項(xiàng)目，結(jié)果均存在日間趨勢(shì)性變化，監(jiān)測(cè)終止時(shí)的結(jié)果與室內(nèi)質(zhì)控血清定值（靶值）相比較也都存在偏差。第1組各項(xiàng)目的日間變異和監(jiān)測(cè)終止時(shí)的結(jié)果偏差較其余兩組小，3組間 ApoA1、LP（a）、Hs－CRP日間變異和監(jiān)測(cè)終止時(shí)的結(jié)果偏差相差極微。見表1。

2.2 組間9個(gè)生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的比較 3組總變異經(jīng)F檢驗(yàn)后有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的項(xiàng)目，再進(jìn)行組間兩兩比較。見表2。ApoA1、LP（a）、hs－CRP 3種添加方法不進(jìn)行組間兩比較，且不同添加試劑方法檢測(cè)結(jié)果間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Cr、ALP、TP、Ca、ALT、AST在第1組的檢測(cè)結(jié)果與第2、3組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而第2、3組結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 4種添加試劑方法9個(gè)生化項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果的比較

表2 9個(gè)生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果三組間的比較

3 討 論

3.1 本組選擇的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目包含了化學(xué)比色類（Cr、ALP、TP、Ca）、酶法類（ALT、AST）、免疫比濁類［LP（a）、ApoA1、Hs－CRP］等不同反應(yīng)類型的試劑，且所選擇項(xiàng)目均具有開瓶穩(wěn)定性較差或試劑使用率較低的特點(diǎn)，其目的是為了觀察易污染和使用頻率不同的常規(guī)項(xiàng)目在3種不同添加試劑方法過(guò)程中的變化情況。為了保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性，添加試劑后均在校準(zhǔn)空白后測(cè)定質(zhì)控結(jié)果。

3.2 化學(xué)比色類ALP、TP、Ca和Cr用不同方式添加試劑時(shí)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中ALP、TP的試劑pH為堿性，開瓶后試劑會(huì)吸收空氣中的CO2，使試劑本身的pH值下降，檢測(cè)結(jié)果發(fā)生偏離，因此應(yīng)了解試劑的特性，及時(shí)對(duì)部分項(xiàng)目進(jìn)行校準(zhǔn)［2］。Ca和Cr在本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與曾平等［1］的結(jié)論相同，這可能與兩者的測(cè)定方法有關(guān)，因?yàn)闇y(cè)定Ca需要在強(qiáng)堿性環(huán)境中進(jìn)行，空氣中的酸性物質(zhì)（如CO2等）易破壞試劑中的堿性環(huán)境（東芝生化分析儀試劑孔是敞開的）。因此試劑很容易與空氣接觸，從而使試劑的pH發(fā)生改變，導(dǎo)致結(jié)果差異［3］。堿性苦味酸法肌酐（Cr）試劑組分中NaOH由于長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中易吸收CO2，使其溶液濃度逐漸降低。NaOH濃度是Jaffe反應(yīng)中影響光譜吸收的重要因素，所以試劑存放須校準(zhǔn)和做質(zhì)控后，質(zhì)控測(cè)定結(jié)果在規(guī)定的允許范圍內(nèi)才能使用［4－6］。

3.3 ALT、AST測(cè)定是典型的酶法反應(yīng)類型，試劑成分中的NADH、ONPG穩(wěn)定性較差，易在空氣中氧化，而NADH降解將造成檢驗(yàn)結(jié)果低值升高而高值偏低［5］。

3.4 LP（a）、ApoA1、Hs－CRP是典型的免疫比濁法檢測(cè)項(xiàng)目，其試劑主要有效成分為抗血清，即蛋白質(zhì)類物質(zhì)，其試劑價(jià)格較為昂貴，一些臨床實(shí)驗(yàn)室這些項(xiàng)目的臨床樣本量較小，因此試劑使用率低；雖本實(shí)驗(yàn)顯示試劑添加方法對(duì)其結(jié)果影響甚微，但日間變異和在監(jiān)測(cè)終止時(shí)結(jié)果偏差仍存在，可能是由于試劑含蛋白質(zhì)成分，易被微生物污染，如試劑開瓶后在試劑倉(cāng)中存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。就目前有的試劑方法學(xué)來(lái)講，還達(dá)不到人們所要求的試劑開瓶后在儀器內(nèi)放很長(zhǎng)時(shí)間不需要定標(biāo)。

3.5 3種不同添加試劑方法以第1種方法最好，沒(méi)有新舊試劑的混合，但是很浪費(fèi)，每次至少要丟掉十幾到幾十人份的試劑，成本增加。后兩種方法雖然節(jié)約，但試劑瓶里新舊試劑混淆，隨著時(shí)間延長(zhǎng)或許里面還有1周甚至1個(gè)月前的試劑而影響檢測(cè)結(jié)果。

3.6 建議上機(jī)使用開封后不穩(wěn)定的試劑而標(biāo)本量又比較少時(shí)，最好選用小劑量試劑瓶上機(jī)，用大瓶上機(jī)時(shí)盡可能正確估計(jì)第2天試劑用量，以免造成新舊試劑的疊加次數(shù)太多，定期更換試劑瓶，另外加試劑后最好校標(biāo)和做質(zhì)控一次，并應(yīng)進(jìn)行校準(zhǔn)后驗(yàn)證。

3.7 一般每個(gè)試劑瓶?jī)?nèi)由于試劑針不能吸完，或多或少都會(huì)留有幾毫升的試劑，為節(jié)約起見，最好的做法是將每個(gè)批號(hào)的剩余試劑留起來(lái)妥善保存，待一定數(shù)量后混在一起，重新定標(biāo)后檢測(cè)。

3.8 有些實(shí)驗(yàn)室和試劑廠家一直共同關(guān)注如何有效延緩試劑開瓶后的衰變過(guò)程，提高試劑開瓶穩(wěn)定性［7］。目前有通過(guò)改良試劑組分或在試劑中添加穩(wěn)定劑來(lái)提高試劑穩(wěn)定性的報(bào)道，已有部分實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目取得較為顯著的效果［8－10］。但此類解決方案多具有項(xiàng)目局限性，且改變?cè)噭┏煞质欠駮?huì)對(duì)檢測(cè)的性能造成影響，尚需進(jìn)行大量評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。國(guó)內(nèi)亦有通過(guò)改良試劑瓶，減少試劑與流動(dòng)空氣接觸的先例，但該方法是否適用于所有自動(dòng)生化分析儀機(jī)型也有待于進(jìn)一步探討［7］。

3.9 本實(shí)驗(yàn)選擇檢測(cè)美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)人基質(zhì)定值質(zhì)控血清（批號(hào)：M774301），它是高濃度值，那么3種添加試劑方法對(duì)中、低濃度的檢測(cè)結(jié)果的影響怎樣？是否與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相同？還需進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)。

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