靛玉紅甲肟對肝癌HepG2細胞周期和凋亡的影響

陳雅婷譚宇蕙* 吳映雅丘鵬翔杜標炎趙 青

（1 廣州中醫藥大學生物化學教研室，廣東 廣州 510006；2 廣州中醫藥大學病理學教研室，廣東 廣州 510006）

靛玉紅甲肟對肝癌HepG2細胞周期和凋亡的影響

陳雅婷1譚宇蕙1* 吳映雅1丘鵬翔1杜標炎2趙 青1

（1 廣州中醫藥大學生物化學教研室，廣東 廣州 510006；2 廣州中醫藥大學病理學教研室，廣東 廣州 510006）

目的 探討靛玉紅甲肟對肝癌HepG2細胞增值和凋亡的影響。方法 分別用0、10、20、40μmol/L靛玉紅甲肟作用于HepG2細胞24、48、72h，采用MTT法檢測細胞抑制率；用0、10、20、40μmol/L靛玉紅甲肟作用于HepG2細胞24h后收集樣品，采用流式細胞術法檢測細胞周期及其凋亡率。結果 MTT法測定靛玉紅甲肟對肝癌HepG2細胞的增殖具有抑制作用，且表現出劑量和時間的依賴性，隨著濃度升高時間加長，抑制明顯（P＜0.01）。流式細胞術測定也表明靛玉紅甲肟對肝癌HepG2細胞有誘導凋亡的作用，凋亡隨著靛玉紅甲肟濃度的增大不斷地增加。細胞形態學方面也可觀察出細胞隨著靛玉紅甲肟劑量和時間的增大而逐漸出現越來越多的凋亡，細胞核染色質深染，聚集于核膜下呈新月形，細胞膜突起呈小泡樣，小泡脫落形成含核小體片段的凋亡小體。結論 靛玉紅甲肟確實可以誘導HepG2細胞凋亡，但靛玉紅甲肟對肝癌細胞作用機制還不明確，需要作進一步的深入研究。

靛玉紅甲肟；HepG2；增值和凋亡

根據最新統計，全世界每年新發肝癌患者約六十萬，居惡性腫瘤的第五位。HepG2細胞，來源于人的肝癌組織。該細胞乙肝表面抗原陰性，對G418有抗性，對人生長激素有刺激反應。靛玉紅多年前就被中國醫科科學院文獻報道動物和臨床均具有治療慢性中幼粒細胞白血病的作用[1]。靛玉紅甲肟是靛玉紅衍生物之一，也被報道可抑制體外多種腫瘤細胞增殖[2]。本文主要觀察靛玉紅甲肟對肝癌HepG2細胞增值和凋亡是否也存在一定的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑、藥品和材料

RPMI1640（Gibco公司），小牛血清（PAA公司），PBS（SOJUBIO公司），靛玉紅甲肟（Sigma公司），MTT（Sigma公司），DMSO（Sigma公司），HepG2細胞（廣州中醫藥大學生化病理教研室）

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

HepG2細胞用含體積分數10%小牛血清的RPMI1640培養液（含青霉素、鏈霉素各100u/mL），在37℃、體積分數5%CO2及飽和濕度條件下培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 藥品配制

靛玉紅甲肟（IRO）分別配制成10，20，40μmol/L備用。

1.2.3 MTT法測定細胞抑制率

用2.5g/L的胰酶消化收集HepG2細胞，計數并重懸于含積分數10%小牛血清的RPMI1640培養液，調整細胞濃度為3×104個/mL，按100μL/孔細胞懸液接種于96孔培養板。置37℃、體積分數5% CO2及飽和濕度條件下培養箱培養24h，細胞貼壁后棄去上清，分別加入含靛玉紅甲肟10，20，40μmol/L的藥液繼續培養，同時設置對應的空白對照孔以及正常對照孔，每組設置4個復孔。分別培養24、48、72h后，吸走藥液，加入不含小牛血清的RPMI1640培養液100μL，再每孔加入10μL MTT溶液（5mg/mL）繼續放進培養箱培養4h。用注射器小心吸走上清，留下藍紫色結晶，加入DMSO 150μL/孔震蕩均勻，在自動酶標儀上以490nm波長測定每孔吸光度值，計算細胞抑制率。抑制率=[1-（實驗組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）]×100%

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡

用2.5g/L的胰酶消化收集HepG2細胞，計數并重懸于含積分數10%小牛血清的RPMI1640培養液，按2×106個/孔接種于6孔培養板，置37℃、體積分數5% CO2及飽和濕度條件下培養箱培養24h，細胞貼壁后棄去上清，分別加入含靛玉紅甲肟10，20，40μmol/L的藥液繼續培養，同時設置對應的空白對照孔以及正常對照孔，每組設置1個復孔。培養24h候，吸走藥液，用2.5g/L的胰酶消化收集每孔細胞，吹打制備單細胞懸液，移入新的5mL離心管中，4℃，1000g，離心5min，取出棄去上清，用4℃PBS洗滌細胞3次，再離心棄去PBS，加入4℃、75%乙醇放4℃冰箱固定細胞過夜。上流式細胞儀PI單染檢測細胞周期及其凋亡。

1.2.5 細胞形態觀察

分別用DAPI和PI染色劑（含破壁滲透劑）對經靛玉紅甲肟10，20，40μmol/L處理過24，48，72h的細胞進行染色，熒光顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 靛玉紅甲肟對HepG2細胞增值抑制作用

MTT結果如表1和圖1所示，其中可以看出，隨著靛玉紅甲肟濃度的增大和作用時間的延長，HepG2細胞的抑制率也逐漸增加，呈劑量和時間依賴性。

表1 各組HepG2 MTT測定結果的細胞抑制率（n=4）

圖1 靛玉紅甲肟對HepG2細胞增值的影響

2.2 流式細胞儀分析細胞凋亡率

HepG2細胞經0、10、20、40μmol/L濃度的靛玉紅甲肟作用24h后，G0/G1期細胞比例逐漸下降，S期細胞無明顯變化，G2/M期細胞比例逐漸上升。凋亡率不斷上升，分別為2.71%，12.36%，19.43%，29.53%。見表2和圖2。

表2 各組HepG2 流式細胞術24h測定結果的細胞抑制率（n=2）

圖2

2.3 細胞形態變化

正常情況下，HepG2細胞貼壁生長細胞飽滿均勻，而在靛玉紅甲肟的作用下，貼壁細胞不斷減少，細胞核染色質深染，聚集于核膜下呈新月形，細胞膜突起呈小泡樣，小泡脫落形成含核小體片段的凋亡小體。如圖3所示。

圖3 HepG2細胞經靛玉紅甲肟各濃度作用48h后DAPI和PI染色形態圖

3 討 論

中國的中醫多年前就已經使用當歸蘆薈丸來治療慢性粒細胞白血病，而其中青黛中含有的靛玉紅成分被證明是起主要治療作用的成分。多年來，人們對靛玉紅進了各方面的研究，但因其水溶性與脂溶性均不良好，且出現胃腸道不良反應較多，因此研究者對其進行結構的改造，發現靛玉紅甲肟就是一種水溶性較好易于吸收且不良反應較小的一種靛玉紅的衍生物[3]。靛玉紅甲肟經本實驗也發現對肝癌HepG2細胞體外是存在著明顯的抑制作用，而且呈現出時間和濃度的依賴性。有報道指出靛玉紅甲肟是一種具有選擇性的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CDK抑制劑）[4]。細胞周期運行中有兩個檢查點，分別是G1/S期檢查點和G2/M期檢查點，細胞周期中細胞時間的發生和順序都被檢查點監控，以保證細胞的正常復制。當細胞DNA受損時，細胞周期就不能正常運行，被阻滯于檢查點，而當損傷超過細胞的修復能力時，則會誘導細胞發生凋亡。有研究證明靛玉紅甲肟具有誘導細胞凋亡的作用，主要是將細胞阻滯在G2/M期[5]。本實驗流式細胞術觀察到了靛玉紅甲肟作用后HepG2細胞凋亡的影響：用藥組的凋亡率高于對照組，呈濃度依賴性，表明靛玉紅甲肟確實可以誘導HepG2細胞凋亡。其細胞周期G0/G1期細胞比例逐漸下降，S期細胞無明顯變化，G2/M期細胞比例上升，對其G2/M期有一定阻滯作用。細胞凋亡首先是細胞收縮變圓，然后與鄰近的細胞脫離。細胞的鐵壁能力會逐漸減弱，胞漿會濃縮，質地致密的染色體會聚集，而后斷裂成許多凋亡小體。本實驗也可觀察到經過靛玉紅處理的HepG2細胞出現這種凋亡的過程。然而目前靛玉紅甲肟對肝癌細胞作用機制還不明確，需要作進一步的深入研究。

[1] 中國醫學科學院血液學研究所,分院附屬醫院,基礎醫學研究所.靛玉紅治療慢性粒細胞白血病的臨床和實驗研究[J].中華內科雜志,1979,18(2):83-88.

[2] Frank G.E,Perabo,Frossler C,et al.Indirubin-3’-monoxime,a CDK inhibitor induces growth inhibition and apoptosisindependent up-regulation of surviving in transitional cell cancer[J].Anticancer Res,2006,26(3A):2129-2136.

[3] Moon MJ,Lee SK,Lee JW,et al.Synthesis and structure activity relationships of novel indirubin derivatives as potent antiproliferative agents with CDK2 inhibitory activities[J].BioorgMe dChem,2006,14(1):237-246.

[4] Hoessel R,Leclerct S,Tang WC,et al.Indirubin,the active constituent of a Chinese antileukaemia medicine,inhibits cyclindepengdent kinases[J].Nature Cell Biology,1999,(1):60-67.

[5] Marko D,Sch?tzle S,Friedel A,et al.Inhibition of cyclindependent kinase 1 (CDK1) by indirubin derivatives in human tumor cells[J].Br J Cancer,2001,84(2),283-289.

Effect of Indirubin-3’-monoxime on Proliferation and Apoptosis of HepG2 cells

CHEN Ya-ting1, TAN Yu-hui1*, WU Ying-ya1, QIU Peng-xiang1, DU Biao-yao2, ZHAO Qing1
(Department of Biochemistry, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006; 2 Department of Pathology, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China)

Objective To discuss the effect of indirubin-3’-monoxime on proliferation and apoptosis of HepG2 cells. Method HepG2 cells were treated with 0, 10, 20, 40μmol/L indirubin-3’-monoxime for 24、48、72hours, then the apoptosis rate was measured by methabenzthiazuron (MTT) assay, also, it was measured by flow cytometry. Use the coloring agent DAPI and PI to dye the HepG2 cells which had been treated, then observe the cell morphology under the fluorescence microscope. Results Indirubin-3’-monoxime inhibited growth of HepG2 cells in a dose-dependent and time-dependent. The apoptosis rate increased after the treatment by indurubin-3’-monoxime at 24 hours, this apoptosis are differences between different dose group. In cell morphology, we can observe that more and more cells apoptosis along with the increasing of a dose and time of indurubin-3’-monoxime.Chromatin of cell nucleus concentrating and anachromasis, gathering in nuclear membranes as crescent-shaped. Cell membranes raised as bubble. The bubble will fall off and formed apoptotic body which contain fragment of nucleosome. Conclusion Indirubin oxime can indeed induce apoptosis in HepG2 cells, but Indirubin oxime on hepatoma cell mechanism is not clear, the need for further in-depth study.

Indurubin-3’-monoxime; HepG2; Proliferation and apoptosis

R735.7

B

1671-8194（2013）22-0003-02

國家自然科學基金面上項目（編號：30973811）

*通訊作者:E-mail: tyhui@gzhtcm.edu.cn