傷寒、甲、乙、丙型副傷寒沙門菌多重熒光PCR方法的評估及臨床應用

馬淑貞石曉路林一曼邱亞群李迎慧扈慶華

（1 深圳市龍崗區龍崗預防保健所，廣東 深圳 518116；2 深圳市疾病預防和控制中心，廣東 深圳 518055）

傷寒、甲、乙、丙型副傷寒沙門菌多重熒光PCR方法的評估及臨床應用

馬淑貞1石曉路2林一曼2邱亞群2李迎慧2扈慶華2

（1 深圳市龍崗區龍崗預防保健所，廣東 深圳 518116；2 深圳市疾病預防和控制中心，廣東 深圳 518055）

目的 建立和評估多重熒光PCR方法快速鑒定傷寒、甲、乙、丙型副傷寒沙門菌的方法，并應用于臨床血培養樣品的檢測。方法 收集留取醫院的可疑傷寒患者的血培養標本，用多重實時熒光PCR法和傳統分離培養法同時進行分離鑒定，分析比較雙盲實驗結果，評價多重實時熒光PCR方法的靈敏度、特異度等檢測性能指標。結果 共檢測臨床樣本538例，多重熒光PCR法檢出陽性218例，比傳統培養法多檢出6例；陰性320例，與傳統培養法一致。以傳統檢測方法為金標準，多重熒光PCR方法的靈敏度為100%，特異度為98.2%。結論 建立的多重熒光PCR檢測方法操作簡便，可快速、特異、靈敏地檢測出傷寒、甲、乙、丙型副傷寒沙門菌，可以應用于臨床標本的早期快速分型診斷，提升重大傳染病的應急處置能力和監測能力。

多重熒光PCR；傷寒沙門菌；甲型副傷寒沙門菌；乙型副傷寒沙門菌；丙型副傷寒沙門菌

目前傷寒、副傷寒的實驗室診斷仍為傳統的血液培養方法及肥達氏反應[1-4]，因傳統的細菌培養所需時間較長（5～7d），更由于抗生素的普遍使用，培養率較低，難以達到早期診斷目的。而肥達氏反應操作繁雜，結果不易觀察，其敏感性、特異性和重復性均不夠理想。近年來隨著分子生物技術的發展，熒光PCR以其快速、特異性好、封閉操作和無需PCR后處理等優點已被廣泛應用于微生物的檢測[5-6]。本文根據傷寒、副傷寒沙門菌vi抗原基因（viaB）[7]、H抗原基因（flic-a）[8]和O抗原合成基因（rfbS和rfbE）[9]等為靶基因設計引物和改良分子信標探針，建立多重熒光PCR方法，對臨床疑似傷寒、副傷寒患者的血液樣本進行檢測，同時用傳統分離培養方法進行檢測，分析比較雙盲實驗結果，評價多重實時熒光PCR方法的靈敏度、特異度等檢測性能指標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源

收集2011年5月至2012年4月臨床疑似傷寒、副傷寒患者血液標本538份，非傷寒副傷寒疑似患者血液標本300份。每份標本采集2管患者血液，每管10mL。

1.1.2 主要試劑和儀器

法國梅里埃的BacT/ALERT 3D全自動微生物培養系統，安捷倫的Mx3005P熒光PCR儀。一次性全封閉血培養瓶，購自法國梅里埃公司。鎂離子、dNTP、Taq酶等購自寶生物工程（大連）有限公司，細菌基因組提取試劑盒購自Qiagen（QIAamp DNA Mini Kit， Cat No.51304）。

1.2 方法

1.2.1 標本的制備

無菌操作采集靜脈血后，立即注入BacT/ALERT系統專用血培養瓶內，成人瓶需8～10mL，小兒瓶需1～3mL，立即送實驗室放入BacT/ ALERT 3D全自動微生物培養系統內培養。每隔6h無菌注射器吸取1mL血培養液體進行PCR和細菌分離培養鑒定，直至血培養瓶報陽后停止取樣和檢測。

1.2.2 血培養樣品DNA模板的提取方法

血培養樣品用4種方法提取DNA模板：①商業化的Qiagen DNA提取試劑盒（QIAamp DNAMini Kit，Cat No.51304），按操作說明進行。②直接水煮離心法：1 m1的血培養液，100℃煮沸5 min.12000 rpm離心2 min，取上清5μL作為熒光PCR模板。③低速離心水煮法：取l mL菌液，按不同的低速離心力和離心時間處理后，取700 μL上清100℃煮沸5 min，12000 rpm離心2 min，取上清5 μL作為熒光PCR模板。④低速離心，高速富集水煮法：取1 m1菌液，按不同的低速離心力和離心時間處理后，取700 μL上清12000rpm離心5 min，棄上清。加入50 μL雙蒸水懸浮沉淀，100℃煮沸5 min，12000 rpm離心2 min，取上清5 μL作為熒光PCR模板。

1.2.3 多重熒光PCR引物及探針

根據H抗原基因（flic-a）[8]、vi抗原基因（viaB）[9]和O抗原合成基因（rfbS和rfbE）基因序列，自行設計引物和探針（序列略），探針的5’端分別標記熒光素FAM、HEX、ROX和CY5，由大連寶生物合成并標記。

1.2.4 實時PCR反應體系

25μL反應體系含1×buffer（10mM Tris-HCL，50mM KCl），3.5mM MgCl2，0.04～0.06 uM引物，0.05～0.2uM各探針，0.3mMdNTP，1.0U Taq酶，5μLDNA模板。熒光PCR反應程序為：95℃ 3min；95℃ 10s，55℃ 32s，72℃ 15s（共40個循環）。使用Mx3005P熒光PCR儀在第二個循環周期的55℃退火階段采集FAM、HEX、ROX和CY5通道的熒光數據。設無菌水作為陰性對照。

1.2.5 細菌分離培養鑒定

按常規方法進行。

2 結 果

2.1 血培養樣品的DNA模板的提取方法

血培養樣品的4種提取DNA模板方法中，樣品按Qigen試劑盒方法提取的DNA模板用于PCR實驗，檢測不到陽性信號，故此方法不適于提取血培養樣品。按直接水煮離心法、低速離心水煮法和低速離心高速富集水煮法提取的DNA模板用于PCR實驗，均檢測到陽性信號。但在操作的簡便性、PCR結果的重復性、Ct值、熒光信號值等方面綜合比較，低速離心水煮法中的1000rpm離心5min的實驗結果最佳。

2.2 多重熒光PCR法與細菌分離培養法檢測結果

在538份臨床診斷疑似傷寒副傷寒病例標本中，使用多重熒光PCR方法檢出陽性218例中，細菌分離培養法檢出陽性212例，即多重熒光PCR方法比傳統分離培養法多檢出6例陽性；陰性320例樣品與細菌分離培養法結果一致。與培養法金標準比較，本研究方法檢測傷寒、副傷寒沙門菌的靈敏度為100%，特異度為98.2%，見表1。

表1 多重熒光PCR法與分離培養法（金標準）檢測結果比較

通過試驗設計統計方法計算得出，本研究方法檢測傷寒、副傷寒沙門菌的靈敏度（真陽性率）為100%，特異度（真陰性率）為98.2%。計算方法如下：

靈敏度（真陽性率）=A/（A+C）×100%=212/212×100%=100%

特異度（真陰性率）=D/（B+D）×100% =320/326×100%=98.2%

2.3 不同病程血液標本的檢測結果

了解不同病程血液標本對多重熒光PCR與細菌分離培養結果的影響，分別采集不同病程患者血液標本進行檢測，結果表明，病程在1～2周的檢出陽性率為最高，詳見表2。

3 討 論

沙門菌（Salmonella）是廣泛分布于自然界中的常見致病菌之一。傳統的沙門菌的分型工作存在諸多不足，特別是對高度相似的菌株進行分型時表現的尤為明顯。近年隨著分子生物技術的發展，尤其是PCR以其快速等優點而被廣泛應用于微生物的檢測。但普通PCR臨床檢測技術每個反應只能擴增1個模板，產物需要開蓋進行瓊脂糖凝膠分析，易造成交叉污染，出現假陽性；也不能短時間內完成大批量樣品多種指標檢測。熒光PCR是公認的高敏感、高特異檢測方法，其操作簡單，檢測時間短，反應產物無需后處理，避免了產物交叉污染的可能。多重熒光PCR方法是在常規熒光PCR法基礎上進一步改進，在同一個反應體系中混合多套引物和探針，通過探針上不同波長的發光基團可同時對多種病原菌進行區別性檢測，具有快速、靈敏、特異、高通量等優點。

表2 不同病程血液標本的檢測結果

本文成功建立了傷寒、甲、乙、丙型副傷寒多重熒光PCR檢測方法，并建立了簡易的血培養物的處理方法。該法對538例臨床血液標本的檢測結果與培養法金標準比較，多重熒光PCR檢測方法的靈敏度為100%，特異度為98.2%，表明該多重熒光PCR方法同時檢測傷寒、甲、乙、丙型副傷寒沙門菌具有簡便、快速、高效、特異、敏感的特點，為臨床傷寒、副傷寒的早期快速分型診斷提供了一個新的診斷方法。可以應用于臨床標本的早期快速分型診斷，提升重大傳染病的應急處置能力和監測能力。

[1] 何曉青.新中國在預防和控制傷寒方面的成就[J].中華流行病學雜志,2000,21(1):61-63.

[2] 閆梅英,梁未麗,李偉,等.1995-2004年全國傷寒副傷寒的流行分析[J].疾病監測,2005,20(8):401-403.

[3] 許學斌,冉陸,朱超.沙門菌分型血清對比研究(上海市,1999至2007)[J].檢驗醫學,2010,25(5):21-25.

[4] Edleman R,Levine MM.Summary of an international workshop on typhoid fever[J].Rev Infect Dis,1986,8(3):329-349.

[5] 扈慶華,鄭薇薇,石曉路,等.雙重實時熒光PCR快速同時檢測霍亂弧菌和副溶血弧菌[J].中華微生物學和免疫學雜志,2004,24(12):1004-1007.

[6] 石曉路,扈慶華,張佳峰,等.多重實時PCR快速同時檢測沙門菌和志賀菌[J].中華流行病學雜志,2006,27(12):1053-1056.

[7] Wetter M, Goulding D, Pickard D, et al. 2012. Molecular characterization of the viaB locus encoding the biosynthetic machinery for Vi capsule formation in Salmonella Typhi[J]. PLoS One,2012,7(9):e45609.

[8] 趙志晶,王斌,梁昊宇,等.傷寒和甲型副傷寒沙門菌復合PCR檢測[J].中國公共衛生,2008,24(2):238-240.

[9] Hirose K, Itoh K, Nakajima H,et al. 2002. Selective amplification of tyv (rfbE), prt (rfbS), viaB, and fliC genes by multiplex PCR for identification of Salmonella enterica serovars Typhi and Paratyphi A[J]. J Clin Microbiol,2002,40(2):633-636.

Assessment and Application of a Multiplex Real-time PCR Assay for Rapid Detection of S typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B and S. Paratyphi C

MA Shu-zhen1, SHI Xiao-lu2, LIN Yi-man2, QIU Ya-qun2, LI Ying-hui2, HU Qing-hua2
(1 Shenzhen Longgang Preventive Health, Shenzhen 518116, China; 2 Shenzhen Center for Disease Control and Prevention, Shenzhen 518055, China)

Objective To establish and evaluate a rapid multiplex real-time PCR(m-rt-PCR) assay for the simultaneous detection of S typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi B and S. paratyphi C. The method could be applied to the rapid diagnosis of clinical blood samples. Methods Suspected blood cultures were collected to simultaneously detect S. Typhi, S. Paratyphi A, B and C by m-rt-PCR assay and standard culture methods. The results of the m-rt-PCR assay were compared with those obtained from traditional culture based methods using a 2×2 table to estimate indices of sensitivity and specificity. Results 538 unknown clinical samples were analyzed by culture, 212 were culture positive. Multiplex real-time PCR detected 218 positive samples. In comparison with culture method, clinical validation showed 100% sensitivity and 98.2% specificity. Conclusion The real -time PCR assay was simple, rapid, sensitive and specific. It could be applied to the rapid diagnosis of S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. paratyphi C and S typhi. The established assay should increase the speed of detection and differentiation of typhoid fever causing organisms in a diagnostic setting.

Multiplex real-time PCR assay; S typhi; S. paratyphi A; S. paratyphi B; S. paratyphi C

R446.5

B

1671-8194（2013）22-0001-02

2012年深圳市科技計劃項目（醫療衛生非資助）（編號：201203360），國家自然科學基金（編號：81071433）