125I粒子持續照射對Sw1990及Panc-1細胞生物學效應的影響

蔣奡，王忠敏，張麗云，茅愛武，劉芬菊

胰腺癌是一種高度惡性的腫瘤，放射治療是目前治療胰腺癌、預防術后復發、延長患者生存期及提高生活質量的重要手段之一［1］。臨床上用于內照射治療的放射性粒子包括125I、103Pd等，Nath等［2］、Wang等［3］和Reniers等［4］分別使用103Pd及125I粒子行細胞照射實驗，得出103Pd比250 KvpX線及125I比60Coγ射線的相對生物學有效性分別為1.24和1.39。125I主要發射27.4 keV和31.4 keV的X線和35.5 keV的γ射線，可使乏氧細胞再氧化，增加了腫瘤細胞的放射敏感性，且不易損傷正常組織［5-6］，125I的t1/2為60.1 d，可提供約200 d的持續照射，以上特點使125I粒子在我國得到了臨床醫師的認可和廣泛應用［7-8］。

目前胰腺癌細胞種類很多，如Panc-1、Sw1990、P3、Capan-1、Capan-2、Aspc-1、Hs766T等［9］。根據美國模式培養物保藏所（ATCC）資料顯示，Sw1990細胞來源于人胰腺癌的脾臟轉移灶，Panc-1細胞是人胰腺導管上皮癌。本研究采用125I粒子持續照射，通過集落形成實驗、細胞凋亡率檢測、細胞周期檢測、3H-TDR摻入實驗比較照射后兩種細胞增殖抑制的主要機制及生物學效應是否存在差異。

1 材料和方法

1.1 材料

人胰腺癌Sw1990細胞株及Panc-1細胞由中科院上海細胞庫提供。BT-125-1型125I粒子由上海欣科醫藥有限公司提供。DMEM培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自德國Biotrom公司，0.25%胰酶購自美國HyClone公司、AnnexinV/PI凋亡試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養

Sw1990及Panc-1細胞體外培養于DMEM培養基中，培養基內加入10%胎牛血清，細胞倍增時間分別為64 h和52 h，用0.25%胰酶傳代。細胞傳代后生長至指數生長期時進行照射。

1.3 照射裝置

根據文獻報道，采用Gray實驗室125I粒子離體照射模型［10］，模型為抽屜式結構，分為兩層，下層放置125I粒子，14枚粒子以35 mm為直徑環形排布，上層為細胞培養板，放置直徑為35 mm的細胞培養皿（圖1）。細胞培養平面的吸收劑量以及照射所需的時間通過測量和計算得出。實驗照射使用平均初始活度為111 MBq（3 mCi）的125I粒子，細胞培養平皿的初始劑量率為12.13 cGy/h，分別給予2、4、6、8 Gy的照射，在持續照射期間，粒子照射模型放置在鉛盒內以防止放射性污染，鉛盒放置在孵育箱內培養。另設一組空白對照，照射組及對照組均設3個平行樣本。

圖1 125I粒子持續照射裝置

1.4 克隆形成實驗

Sw1990及Panc-1細胞培養至指數生長期時，用含EDTA的胰酶消化成單細胞，分別接種于不同細胞數的培養皿中，加入2 ml培養液，待細胞貼壁后分別行0、2、4、6、8 Gy照射，照射后細胞置孵育箱培養14 d，培養過程中3 d換1次新鮮培養液。14 d后用甲醇固定，吉姆薩染色后顯微鏡下計數（50個細胞以上為1個集落形成單位），實驗重復3次，每個劑量點設3個平行樣本，計算集落形成率（PE）及細胞存活率（SF）。

1.5 細胞凋亡率及細胞周期檢測

1.5.1 凋亡率檢測Sw1990及Panc-1細胞照射達到相應吸收劑量（2、4、6、8 Gy）后，與對照組（0 Gy）一起繼續培養48 h，收集細胞，離心洗滌后重懸，加入AnnexinV及PI染色后，置冰上送流式細胞儀檢測。每組均設3個平行樣本并重復3次實驗。

1.5.2 細胞周期檢測兩種細胞照射達到相應吸收劑量（2、4、6、8 Gy）后，與對照組一起繼續培養24 h，收集細胞，離心洗滌，加入體積分數為70%乙醇固定過夜。流式細胞儀檢測前離心去掉乙醇，加入RNA酶分解RNA，并行PI染色，上機檢測。每組均設3個平行樣本并重復3次實驗。

1.6 3H-TDR摻入實驗

細胞增殖時需要利用胸腺嘧啶核苷酸（TDR），若將合成DNA的前體物質胸腺嘧啶核苷酸用放射性同位素3H標記，合成3H-TDR，加入到培養體系中，即可被細胞攝取而摻入到DNA分子中。培養終止后，測定腫瘤細胞內3H-TDR的摻入量，與對照組比較，反映出照射后細胞DNA合成情況。分別計數Sw1990及Panc-1細胞，接種相同的細胞數（1×105個細胞）至35 mm培養皿中，貼壁后行125I放射性粒子持續照射，照射劑量分別為2、4、6、8 Gy。照射后3 h每個照射皿注入10μl的3H-TDR，加入后24 h收獲細胞，加入2 ml閃爍液，用液體閃爍計數儀檢測細胞放射量。每個劑量設3個平行樣，另設3個對照皿。

1.7 統計學處理

采用SAS9.1（NC，USA）軟件進行統計學分析并擬合細胞存活曲線，Excel 2007（CA，USA）繪圖。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞克隆形成率

14 d后計數各劑量點克隆數（計數50個細胞以上的為1個集落形成單位），計算各劑量點的SF（照射組PE/對照組PE×100%），根據線形二次模型對SF與劑量之間的關系進行擬合，擬合方程為SF=e-αD-βD^2，求出SF2（2 Gy時的SF擬合值），結果見圖2。經計算，Sw1990細胞的SF2為0.766±0.063，Panc-1細胞的SF2值為0.729±0.045，經獨立樣本t檢驗，兩種細胞的SF2差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 細胞擬合存活曲線

2.2 細胞凋亡率

照射結束后繼續培養48 h，染色并上機送檢，結果見圖3。

圖3 隨照射劑量增高，兩種胰腺癌細胞凋亡率逐漸增高

2.3 兩種細胞照射后的細胞周期

見表1。

表1 兩種細胞照射后的細胞周期（±s）

表1 兩種細胞照射后的細胞周期（±s）

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2.4 3H-TDR摻入實驗

經液體閃爍計數器測定，Sw1990細胞的3HTDR放射量隨照射劑量增高逐漸降低，6 Gy時達到最低，8 Gy時放射量增高，但明顯低于4 Gy。Panc-1細胞的3H-TDR放射量也隨照射劑量增高逐漸降低，6 Gy時達到最低。計算細胞DNA合成率，設對照組3H-TDR放射量為1（圖4）。

圖4 兩照射組DNA合成率

經方差分析，Sw1990及Panc-1細胞在2 Gy劑量照射下，3H-TDR放射量與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），表明2 Gy的累積照射劑量可能不足以抑制這兩種細胞的DNA合成。兩種細胞3HTDR放射量在4 Gy比6 Gy、4 Gy比8 Gy時差異均有統計學意義（P＜0.05），但6 Gy比8 Gy的差異則無統計學意義（P＞0.05），兩種細胞各劑量組之間差異亦無統計學意義（P＞0.05）。Sw1990、Panc-1細胞在8 Gy劑量照射后的3H-TDR放射量均比6 Gy時高，且Sw1990細胞增幅更為明顯，可能是因為Sw1990細胞倍增周期更長，在累積劑量達8 Gy時，細胞已完成了部分DNA修復工作。

3 討論

放射治療是治療腫瘤的有效手段，臨床上常用的放射性粒子包括125I、103Pd、131Cs等，具有劑量率低，可反復植入、適形照射的特點，與外照射相比提高了腫瘤靶區的照射劑量，降低了周圍正常組織的照射損傷，減少了并發癥的發生。

腫瘤細胞放射致死主要是發生了增殖性死亡，即細胞經過照射后雖然形態依然存在，但已不能無限分裂，克隆形成實驗能很好地反映離體細胞的分裂增殖特性。目前的研究認為，照射所致的細胞凋亡及G2/M期阻滯是其抑制腫瘤生長的主要方式，這與我們的研究結果相符。研究125I治療前列腺癌患者的學者認為其是通過下調抑制細胞凋亡的Bcl-2蛋白的表達及影響Caspase家族從而產生抑制作用［11］，也有學者認為改變DNA甲基轉移酶類型也是機制之一［12］。3H標記的胸腺嘧啶核苷酸作為DNA合成的原料之一，當DNA受到損傷時其合成能力下降，因此3H-TDR摻入率也會下降，但修復細胞DNA損傷時也需使用3H-TDR，其摻入量又會有所升高，測定腫瘤細胞內的3H-TDR的放射量可以反映細胞DNA合成量。但總的放射量是由細胞DNA合成抑制和DNA損傷修復共同作用的結果。究竟何種劑量下DNA合成抑制程度最大尚少見報道。本實驗使用125I粒子完成0、2、4、6、8 Gy劑量的照射后，采用克隆形成實驗檢測照射后細胞體外分裂能力、凋亡率及細胞周期以及3H-TDR摻入實驗探究照射后的細胞DNA合成情況。結果表明，在0～8 Gy的持續照射下，Panc-1及Sw1990細胞克隆形成率隨照射劑量增加而逐漸減少，反映細胞放射敏感性指標SF2在兩者間差異無統計學意義。Panc-1細胞在劑量為6 Gy時G2/M期阻滯達到最大，而Sw1990細胞則在8 Gy時達到最大，這可能與Sw1990細胞倍增周期更長有關（52 h比64 h），該范圍內兩種胰腺癌細胞的放射敏感性無顯著差異，作為實驗對象選擇時無差異性。

放射性粒子組織間近距離照射已被證明在抑制腫瘤生長方面有顯著療效，進一步探究其產生作用的分子機制以及治療不同腫瘤時的最適劑量是未來亟待解決的問題。

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