苗藥秤鉤風中青藤堿的提取工藝研究

徐定平

（湖北省恩施土家苗族自治州中心醫院，湖北 恩施 445000）

苗藥秤鉤風中青藤堿的提取工藝研究

徐定平

（湖北省恩施土家苗族自治州中心醫院，湖北 恩施 445000）

目的 研究苗藥秤鉤風中青藤堿的最佳提取工藝，擴展土家苗藥的應用領域。方法 以酸堿法提取苗藥秤鉤風中的青藤堿成分，考察提取溶劑用量、提取酸液的 pH、堿化液的 pH 和堿化時間對青藤堿提取率的影響，用高效液相色譜法測定含量。結果 對秤鉤風中青藤堿的提取率的影響因素大小依次是提取溶劑 pH 值、堿化 pH 值、提取溶劑用量，最佳的提取工藝為以 1 ∶ 10 的量加入 pH 為 3 的提取溶劑，堿化的氨水 pH 值為 8。結論 以最佳提取工藝提取的青藤堿含量穩定，該方法合理可行。

秤鉤風；青藤堿；正交實驗；最佳提取工藝

苗藥秤鉤風系防己科秤鉤風屬秤鉤風Diploclisia affinis （Oliv.）Diels的木質莖和根，又名穿墻風、九層皮和追骨風等，湖北省恩施土家苗族自治州是其主要分布產地之一[1,2]。秤鉤風性味苦寒，具有祛風除濕，清熱解毒，活血，利尿等功效，民間常用于治療風濕骨痛、 尿路感染、毒蛇咬傷等癥[2,3]。有研究表明，其藤莖中含有多種化學成分如三萜、三萜皂苷、生物堿、蛻皮甾酮等，青藤堿是其中一種生物堿成分[4,5,6]。青藤堿具有顯著的鎮靜、鎮痛、消炎、抑制免疫和降血壓等作用，是一種效果好、副作用小的非甾體類消炎止痛藥物，并有望用于戒除藥物成癮性的治療[7,8]。本研究通過考察不同因素對苗藥秤鉤風中青藤堿提取率的影響，篩選出最佳的提取工藝，為其進一步研究提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 供試材料

秤鉤風采集于湖北省恩施土家苗族自治州利川市汪營鎮，經恩施州藥檢所鑒定為防己科秤鉤風屬植物秤鉤風（Diploclisia aff inis（Oliv.）Diels）。

1.2 儀器

RE252A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SH22D（Ⅲ）循環水式真空泵（鄭州長城科工貿易有限公司）；GU21901雙光束紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；電子分析天平（日本島津AUW120D，十萬分之一）；waters高效液相色譜儀（Waters515泵，2487檢測器）等。

1.3 藥物與試劑

色譜乙腈（美國TE-DA），色譜甲醇（美國TEDA），其他試劑如濃氨試液、石油醚、氯仿、甲醇等均為分析純；含量測定用青藤堿對照品（中國藥品生物制品檢定所,批號:0774-9904）。

2 實驗方法建立

2.1 青藤堿的提取工藝

秤鉤風干燥根莖粉碎，過40目篩，備用。精密稱取秤鉤風粉末50g，加石油醚浸泡24h，過濾。濾渣用一定pH值的酸水提取12h。提取3次，過濾，濾液濃縮后加甲醇溶解，以一定pH值的氨水堿化2h，過濾，保留浸膏，加甲醇溶解，以氯仿萃取，揮去溶劑，得青藤堿粗提取物。

2.2 檢測方法的建立

2.2.1 色譜條件

ODS-C18柱（250mm×4.6mm,5μm）；水（用磷酸及三乙胺調整pH至7.8）：乙腈（40∶60）；柱溫：室溫；流速：1.0mL/min；檢測波長：262nm；進樣量：10μL。

2.2.2 標準品溶液的配制

精密稱取60℃下干燥至恒重的青藤堿對照品5mg，置25mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.2mg/mL的標準品溶液。2.2.3 標準曲線的制備

精密吸取對照品溶液0.5、1、2、4、6、10mL的標準品溶液分別至10mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，經0.45μm微孔濾膜濾過后按照2.2.1項下色譜條件進樣，以峰面積A對進樣濃度C進行線性回歸，得A=10114.6C+9833.7，r=0.9997。表明青藤堿濃度在10～200μg/mL的范圍內線性關系良好。

2.2.4 精密度實驗

精密吸取濃度為40μg/mL的青藤堿對照品溶液，經0.45μm微孔濾膜濾過后按照2.2.1項下色譜條件進樣6次，每次3針，計算平均峰面積的RSD為1.05%，顯示一起的精密度良好。

2.2.5 穩定性實驗

精密吸取濃度為40μg/mL的青藤堿對照品溶液，經0.45μm微孔濾膜濾過后分別于2、4、6、8、12、16、20、24h進樣，每次進樣3針，計算平均峰面積的RSD為0.92%，顯示青藤堿溶液在24小時內穩定。

2.3 正交實驗設計

根據預試驗結果，對青藤堿提取率影響較大的因素包括提取溶劑用量（A）、提取溶劑酸水pH值（B）、堿化pH值（C），且提取溶劑的pH值和堿化的pH值分別應在2～4，8～10的范圍內。采用正交實驗的方法L9（34），每個因素選取3個水平進行試驗（表1）。

表1 正交實驗的因素和水平

3 結果與分析

3.1 正交實驗結果分析

正交實驗結果見表2。由表2的極值R可以看出3各因素對青藤堿提取率的影響，其影響主次順序是B＞C＞A，即主要的影響因素是提取液酸水的pH值，其次是堿化pH值和提取溶劑用量，并得出該正交實驗的最佳組合是A2B2C2。對表2中的數據進行方差分析，表明各因素對青藤堿的提取率的影響有顯著性意義，即提取溶劑用量和pH、堿化溶劑的pH均對青藤堿的提取率有較大影響。

3.2 正交實驗結果驗證實驗

按照最佳工藝條件進行5批驗證試驗，即精密稱取秤鉤風粉末50g，加石油醚浸泡24h，過濾。濾渣用500mL pH3的酸水提取12h，提取3次，過濾，濾液濃縮后加甲醇溶解，以pH8的氨水堿化2h，過濾，保留浸膏，加甲醇溶解，以氯仿萃取，揮去溶劑，得青藤堿粗提取物。粗提取物加甲醇溶解后過0.45μm微孔濾膜后進樣，按2.2.1項下色譜條件測定其含量，計算青藤堿的提取率分別為0.033%，0.031%，0.035%，0.033%，0.036%，其平均值為0.0336%，即秤鉤風中青藤堿的含量約為0.336mg/g。實驗結果比較穩定，與正交實驗結果接近。

表2 L9（34）正交實驗結果

表3 方差分析結果

4 討 論

本實驗對秤鉤風碎末用石油醚做了脫脂處理，降低了脂溶性物質對實驗結果的影響，采用酸堿法針對青藤堿這一生物堿成分進行了提取和精制，并以氯仿萃取洗去雜質，使得粗提取物中青藤堿含量較高。此外本實驗以高效液相色譜法測定粗提取物中生物堿的含量，此法更為靈敏，簡單可靠，在實驗中較紫外法可以更好的排除其他物質的干擾。

[1]方志先.湖北恩施藥用植物志[M].武漢:湖北科學技術出版社, 2006.

[2]中國科學院華南植物研究所.廣東藥物志[M].廣州:廣東科技出版社,1987:36.

[3]南京中醫藥大學.中藥大辭典[M].上海:上海科學技術出版社, 2006.

[4]Miller RW,Clardy J,Kozlowski J,et al.Phytocedy steroids of Diploclisia glaucescens[J].Planta Med,1985,51(1):40-42.

[5]Jayasinghe ULB,Wannigama GP,Macleod JK.Glucuronides of Diploclisia glaucescens[J].J Chem Soc Pakistan,1998,20(2):131-137.

[6]Bandara BMR,Jayasinghe ULB,Karunaratne V,et al.Triterpenoidal constituents of Diploclisia glaucescens.[J].Planta Med,1990, 56(3):290-292.

[7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:化學工業出版社,2005:155-158 .

[8]Lei HM,Zhu R,Weil X.Chemical constituents of Patrinia heter ophylla[J].Chin Pharm J,1997,32(5):2712-2731 .

Study on the Optimum Extraction Process of Sinomenine Existed in Miao Medicine Named Diploclisia Affinis

XU Ding-ping
(Central Hospital of Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture, Enshi 445000, China)

ObjectiveTo study the optimum extraction process of sinomenine which exist in Miao medicine named Diploclisia affinis,and to extend the applications of minority medicine.MethodsUsing Acid-alkali method to extract sinomenine from the Diploclisia affinis,investigating the effects of extract solvent’s dosage and pH value,the alkalify solvent’s pH value on extraction rate of sinomenine,HPLC was used as detection method.ResultsFactors influencing sinomenine’s extraction rate followed a descending order of extract solvent’s pH value, alkalify solvent’s pH value and extract solvent’s dosage. It showed that the optimum extraction process was extract solvent’s pH value was 3,lkalify solvent’s pH was 7 and extract solvent’s dosage was 1∶10.ConclusionWhen applied the optimum extraction process to extract the sinomenines,the extraction rate was stability and closed to the orthogonal experimental results.The extraction method is rational and feasible.

Diploclisia affinis; Sinomenines; Orthogonal experiment; The optimum extraction process

R284.1

：B

：1671-8194（2013）08-0030-02