腦源性多器官功能障礙綜合征大鼠下丘腦內FOS、NOS、P 物質的表達及意義

王興邦，麻 琳，郭洪志，屈傳強

(1山東大學齊魯醫院，濟南250012;2山東省立醫院)

腦源性多器官功能障礙綜合征(CMODS)是急性重癥腦組織損傷引起的多器官功能障礙。既往我們通過對急性腦血管病、下丘腦、垂體、靶腺軸進行的相關研究［1，2］，并結合國內外資料認為，迷走神經及其遞質乙酰膽堿和相應受體參與構成的膽堿能抗炎通路［3］在CMODS的發病中具有重要作用。但是，下丘腦在不同迷走神經狀態下對CMODS的作用及機制尚不清楚。2010年10月～2011年1月，我們通過制作CMODS大鼠模型對此問題進行了研究。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物與分組 成年健康雄性Wistar大鼠(清潔級)100只，體質量250～300 g，由山東大學實驗動物中心提供。用隨機數字表將大鼠分為假手術組、腦出血組(CH組)、迷走神經切斷組(SDV組)、腦出血+迷走神經切斷組(CH+SDV組)和腦出血+迷走神經刺激組(CH+SIV組)各20只。

1．1．2 試劑與儀器 兔抗—氧化氮合酶(NOS)抗體，兔抗P物質抗體，兔抗FOS抗體，生物素標記的羊抗兔IgG，生物素卵蛋白辣根過氧化酶復合物(以上均購自武漢博士德有限公司);Ⅶ型膠原酶(美國Sigma公司)，顯微圖像分析儀(Meta．MarPh/DP10/BX51型)，照相顯微鏡(OLYMPUS)。

1．2 方法

1．2．1 動物模型制作 大鼠禁食12 h，禁水4 h，以1%戊巴比妥溶液40 mg/kg腹腔注射麻醉。參照Rosenberg等所述方法和大鼠CMODS模型法，以Ⅶ型膠原酶0．8 IU和3．2 IU肝素鈉注射液共2μL尾狀核內立體定向注射。假手術組注射同體積生理鹽水，余步驟同出血組。

1．2．2 迷走神經切斷及刺激術 SDV大鼠麻醉后行剖腹術，于胃小彎處暴露迷走神經左右兩干支，在距離迷走神經各分支(胃支、肝支和腹腔支)約5 mm處用絲線結扎左右兩干支并切斷。SIV組大鼠手術暴露雙側頸部迷走神經;將銀質電極做成套圈柄，套圈柄及外側刷絕緣漆，套圈內側為電極面，將套圈扣住迷走神經，灌入石蠟油與周圍組織絕緣，從頸部后面穿出皮膚，縫合切口。CH+SDV組和CH+SIV組迷走神經干預術4周后制作腦出血模型。CH+SIV組大鼠腦出血術后24 h內給予5 V、1 Hz、2 ms的持續電刺激迷走神經，每次20 min，4 h 1次，共6次。

1．2．3 血液學與病理學檢查 腦出血術后24 h，經頸靜脈抽血 2 mL，進行 ALT、AST、BUN、Cr、LDH 檢測;行肝臟、腎臟、肺臟、小腸組織病理學檢查。

1．2．4 下丘腦內遞質表達檢測 采用免疫組化ABC法檢測NOS、FOS蛋白、P物質表達，操作步驟嚴格按照免疫組化試劑盒說明書進行。照相顯微鏡拍照，經顯微圖像分析儀處理，計算下丘腦內FOS蛋白陽性細胞總和以及NOS、P物質陽性神經元單位面積內灰度值。

1．2．5 統計學方法 應用SPSS15．0統計軟件包進行處理，數據以ˉx±s表示，組間均數比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 各組肝腎功能、心肌酶學指標比較 腦出血術后24 h，各組肝腎功能、心肌酶學指標比較見表1。

2．2 各組器官組織病理改變 假手術組、SDV組大鼠各器官組織病理大致正常。CH組肺臟、肝臟、腎臟、小腸均可見非特異性炎癥改變;CH+SIV組主要臟器炎性改變均較CH組和CH+SDV組減輕。CH+SDV組除腎臟外其余臟器病理改變均較CH組明顯。

表1 各組肝腎功能、心肌酶學指標比較(ˉx±s)

2．3 各組下丘腦內NOS、FOS、P物質陽性表達假手術組下丘腦內發現少數淺染的FOS蛋白陽性細胞及NOS、P物質表達，SDV組下丘腦內FOS蛋白陽性細胞及NOS、P物質表達較假手術組略多，但無統計學差異(P均＞0．05)。CH+SDV組大鼠下丘腦內FOS蛋白陽性細胞及NOS、P物質表達主要集中在前部(視前區和視上區)、中部(結節區)。CH+SIV組下丘腦內FOS蛋白陽性細胞及NOS、P物質表達廣泛分布于下丘腦各部。各組大鼠下丘腦內FOS、NOS、P物質表達比較見表2。

表2 各組下丘腦內FOS、NOS、P物質表達比較±s)

表2 各組下丘腦內FOS、NOS、P物質表達比較±s)

注:與假手術組比較，▲P＜0．01;與 SDV 組比較，●P＜0．01;與CH組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與 CH+SDV 組比較，△P ＜0．01

組別 n FOS(個/3高倍視野) NOS(相對灰度值) P物質(相對灰度值)假手術組10 5．80 ±1．46 101．15 ±10．50 85．42 ±12．23 SDV 組 10 6．26 ±1．62 105．71 ±11．45 90．89± 8．22 CH組 6 92．05±8．06▲● 149．55±10．56▲● 116．17± 9．30▲●CH+SDV組 5 76．30±7．05▲●＊＊ 129．40±12．75▲●＊＊ 96．51±14．08▲●＊CH+SIV 組 6 112．60±9．76▲●＊△ 168．28±13．80▲●＊△132．83±12．63▲●＊△

3 討論

下丘腦是神經內分泌及自主神經系統的整合中樞，是維持機體內環境穩定和控制內分泌功能活動的重要結構，與腦內各部位有廣泛的突觸聯系，其神經遞質比較復雜，損害后可產生嚴重的內臟功能紊亂。其中，下丘腦室旁核(PVN)在調節血壓時發揮重要作用，通過下行通路與延髓迷走神經運動背核和孤束核(NTS)、脊髓外側角等部位聯絡而影響內臟自主活動。同時，孤束核也發出神經纖維投射到下丘腦，內臟器官受到刺激后可經迷走神經傳入活化 NTS、PVN、視上核等部位［4］，引起神經—內分泌—免疫反應。目前已知多種神經遞質和受體集中在下丘腦、垂體、延髓區(單胺類物質、肽類物質為最主要的神經遞質)，廣泛參與神經內分泌免疫活動［5，6］。我們前期研究顯示，CMODS 過程中乙酰膽堿、血管活性腸肽等遞質在延髓內臟帶中表達增加，與急性重癥疾病有著密切聯系;基于此，我們探索下丘腦在CMODS中的作用以及其可能的途徑。

FOS蛋白是 c-fos基因的表達產物［7］，c-fos基因參與細胞的生長、分化、信號傳導等生理功能，腦損傷及腦血管病等顱腦應激因素可誘發細胞核內cfos基因迅速大量表達產生FOS蛋白，故而FOS蛋白作為一種有效反映神經元對外界傷害性刺激發生反應的標志而被廣泛應用。既往研究顯示，大鼠盲腸穿孔術模型平均動脈壓進行性下降，血漿TNF-α顯著升高，肝臟炎性病理改變明顯;給予迷走神經電刺激后，癥狀及生化、病理結果均明顯改善［8］。我們前期研究已證實，內毒素及肝臟、腸道內毒素受體異常表達在CMODS發生中起重要作用［9］，且延髓內臟帶及迷走神經在CMODS大鼠中具有中樞炎癥信號的傳出和外周炎癥信息傳入的雙向通路作用，增強傳出迷走神經的活性能明顯減輕外周臟器的功能損害和病理改變［10］。本實驗中切斷迷走神經后大鼠各臟器非特異性病理表現較CH組明顯加重，下丘腦內NOS、P物質表達減少，刺激迷走神經則能增加其表達，其表達與大鼠臟器功能改變呈相反的變化趨勢。這表明急性腦血管病致CMODS時，作為神經—內分泌中樞的下丘腦，其內遞質發生變化，隨迷走神經干預狀態不同，遞質變化不同，內臟功能隨之相應變化。在下丘腦發揮中樞調控作用的過程中，迷走神經遞質變化是重要的神經機制之一，當然可能還有許多其他神經內分泌免疫途徑，但NOS、P物質可能是發揮調控作用復雜環節的基礎。

由此推測，急性腦血管病、腦外傷等腦源性應激時，顱內結構直接或間接破壞，可以直接或間接損傷下丘腦，導致功能紊亂。腦底部中線結構移位造成垂體柄及門脈血管的牽拉與損傷，垂體損害后，神經遞質調節障礙而引起相關應激激素異常分泌，進而興奮植物神經系統;另一方面過度活化腦區的激素受體以及神經纖維、神經遞質的聯絡異常而引起交感神經、副交感神經平衡失調，導致內分泌、心血管、胃腸、呼吸等系統調控紊亂，甚至引起多器官功能衰竭。因此，研究急性重癥腦損傷所致CMODS時下丘腦的作用及機制，對指導臨床意義重大。下丘腦及延髓內臟帶作為內臟活動調節的中樞［11］，迷走神經通過向下丘腦傳遞炎癥信息和接收下丘腦發出的命令而調節炎癥反應的變化，在此過程中，FOS、NOS、P物質和乙酰膽堿一樣發揮了重要作用［12，13］。如果迷走神經通路被阻斷而不能完成雙向傳遞的作用，就會引起一系列炎癥因子的改變進而導致炎癥失衡，增加機體主要臟器的損害，進而發生全身炎癥反應乃至MODS。如果順利完成循環通路，就可能會使原本嚴重的炎癥反應達到平衡，從而改善機體狀態。當給予迷走神經刺激時，機體全身炎癥反應減輕，炎癥因子瀑布減輕或阻斷，向更有利于自身免疫平衡方向發展，盡量避免或減少形成MODS的可能，從而改善預后。因此，神經免疫調節將來可能是全身炎癥反應綜合征的治療方向之一［14］。當然，下丘腦的中樞調控作用機制異常復雜，更多問題有待深入研究。

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