葛根素對(duì)慢性乙醇中毒小鼠胃竇黏膜胃泌素、生長(zhǎng)抑素表達(dá)的影響

夏白娟，崔淑芹

(1貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院組織胚胎教研室，貴陽(yáng)550004;2德州學(xué)院醫(yī)學(xué)系)

目前，乙醇性胃腸道疾病的發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì)。葛根素作為解酒藥［1～3］，其對(duì)乙醇性肝損傷、股骨頭壞死等疾病的干預(yù)作用也有不少報(bào)道［4～6］。2013年2～7月，我們通過(guò)觀察葛根素對(duì)慢性乙醇中毒模型大鼠胃竇黏膜胃泌素(Gas)、生長(zhǎng)抑素(SS)表達(dá)的影響，探討葛根素對(duì)慢性乙醇中毒的可能治療作用。

1 材料與方法

1．1 材料 2%的注射用葛根素(山東瑞陽(yáng)制藥有限公司生產(chǎn));乙醇為56%的紅星二鍋頭(北京懷柔紅星股份有限公司)。生后6周雄性BALB/C小鼠24只(首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供)，體質(zhì)量為22～26 g。

1．2 方法

1．2．1 模型制作 雄性健康BALB/C小鼠24只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食。室內(nèi)溫度恒定在 (22±2)℃，相對(duì)濕度為60% ～65%，每天12 h的亮/暗循環(huán)。隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組(SC組)、慢性乙醇中毒組(CAI組)和葛根素干預(yù)組(PUE組)，每組8只。CAI組和PUE組用56%乙醇進(jìn)行灌胃:第1周劑量為6 mL/kg，第2周和第3周為12 mL/kg，第4周為15 mL/kg進(jìn)行灌胃，每天1次灌胃(上午9∶00)，前兩周每天給予體積數(shù)為0．1的乙醇隨意飲用，后兩周每天給予體積數(shù)為0．2的乙醇隨意飲用。SC組給予相當(dāng)劑量的生理鹽水進(jìn)行灌胃。PUE組在給予乙醇灌胃的同時(shí)按照葛根素1 mg/10 g的劑量行腹腔注射。SC組、CAI組小鼠用與PUE組葛根素相當(dāng)體積的生理鹽水進(jìn)行腹腔注射，為期4周。

1．2．2 取材和標(biāo)本制備 于末次給藥當(dāng)晚禁食，自由飲水，24 h后斷頭處死小鼠，取胃竇組織，置于Bouin液內(nèi)再固定。常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的連續(xù)切片。

1．2．3 Gas、SS表達(dá)檢測(cè) 免疫組織化學(xué)單染法每例觀察切片5張以上，切片間隔56μm。主要步驟:切片常規(guī)脫蠟至水，室溫下10%甲醇H2O2處理10 min，正常羊血清(1∶50)室溫下封閉30 min。分別滴加一抗(兔抗Gas血清，工作濃度1∶100;兔抗SS血清，工作濃度1∶100，武漢博士德生物工程公司)，4℃孵育過(guò)夜，羊抗兔IgG(1∶100博士得生物工程公司)37℃孵育20 min，SABC復(fù)合物(1∶100)37℃孵育20 min，DAB-H2O2液顯色，蘇木精輕度復(fù)染細(xì)胞核，中性樹(shù)膠封片。對(duì)照研究方法:PBS緩沖液代替特異性抗血清作為陰性對(duì)照，余步驟相同。隨機(jī)選取各組小鼠胃竇切片5張，應(yīng)用BioMias圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。在40倍物鏡下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的Gas和SS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并測(cè)其平均灰度值。

1．2．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間比較用單因素方差分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 胃竇Gas陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá) 光鏡下觀察，小鼠胃竇的Gas免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)顆粒狀，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核淡藍(lán)色;對(duì)照切片未見(jiàn)免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞。Gas陽(yáng)性細(xì)胞存在于幽門(mén)腺，散在于上皮細(xì)胞間。呈點(diǎn)狀分布成條帶樣，與胃黏膜表面平行。細(xì)胞呈錐體形、梭形、圓形、橢圓形或不規(guī)則形，有的細(xì)胞發(fā)出細(xì)長(zhǎng)突起直達(dá)腺腔或伸向鄰近細(xì)胞。各組Gas陽(yáng)性細(xì)胞的分布及形態(tài)大致相同，免疫染色強(qiáng)度無(wú)明顯差異。圖像分析結(jié)果顯示:PUE組Gas陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比CAI組明顯減少(P＜0．05)，和SC組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05);三組Gas陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。見(jiàn)表1、圖1。

2．2 胃竇SS陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá) 光鏡下見(jiàn)小鼠胃竇SS陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)多樣，呈卵圓形、梭形或不規(guī)則形，有的細(xì)胞可見(jiàn)突起，細(xì)且長(zhǎng)，主要分布于腺上皮之間，免疫產(chǎn)物呈棕黃色或棕黑色，定位于胞質(zhì)內(nèi)。三組胃竇內(nèi)的SS陽(yáng)性細(xì)胞在分布及形態(tài)上無(wú)明顯差異。與CAI組比較，PUE組和SC組內(nèi)的SS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，且免疫染色強(qiáng)度增強(qiáng)，平均灰度值降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0．05)。PUE組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和平均灰度值與SC組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0．05)。見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組胃竇Gas、SS陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(個(gè)/視野，ˉx±s)

圖1 各組胃竇黏膜Gas、SS陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值

3 討論

乙醇是影響全身的毒性物質(zhì)，對(duì)機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)有極大的影響［7］。乙醇經(jīng)口攝入后，可直接破壞胃的黏膜黏液屏障，使胃黏膜受損，引起胃黏膜充血、糜爛、出血，甚至淺表性潰瘍等，是一種常見(jiàn)的黏膜致死物質(zhì)。長(zhǎng)期高濃度攝入乙醇對(duì)胃腸道內(nèi)分泌系統(tǒng)也有影響。

Gas是研究最早、最多的多肽激素，主要由胃竇和小腸黏膜的G細(xì)胞分泌。Gas素通過(guò)直接刺激壁細(xì)胞的Gas受體而刺激壁細(xì)胞分泌胃酸，也間接通過(guò)類腸嗜鉻細(xì)胞(ECL細(xì)胞)的Gas受體刺激ECL細(xì)胞釋放組胺，再以旁分泌方式激活壁細(xì)胞H受體而使之泌酸［8］;Gas還能增加胃腸道的運(yùn)動(dòng)［9，10］，使胃、腸、膽囊的收縮作用加強(qiáng);并且Gas還是一種免疫調(diào)節(jié)肽，能參與調(diào)控多種炎癥因子［11］，對(duì)維持胃黏膜完整性有一定的作用。

本實(shí)驗(yàn)中，CAI組小鼠胃竇黏膜Gas陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，提示在乙醇毒性作用下，胃竇黏膜Gas分泌過(guò)多，一方面促進(jìn)了胃酸的分泌，使黏膜屏障進(jìn)一步破壞，引起黏膜充血、出血、糜爛等表現(xiàn);另一方面Gas促進(jìn)胃腸平滑肌的收縮，促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，加速轉(zhuǎn)運(yùn)，引起腹瀉等癥狀。

SS是一種典型的腦腸肽，廣泛分布于腦、胰、腸道神經(jīng)細(xì)胞和胃黏膜內(nèi)，由D細(xì)胞分泌。胃腸內(nèi)分泌細(xì)胞大多屬于開(kāi)放型，通過(guò)直接感受胃腸腔內(nèi)化學(xué)物質(zhì)濃度的變化，而使其合成和分泌受到影響。SS對(duì)體內(nèi)許多生物活性物質(zhì)的分泌具有抑制作用，在胃腸道可以直接作用于 G細(xì)胞抑制Gas的分泌［12］，影響血管活性腸肽、腸促胰酶肽等其他胃腸激素釋放。此外，還能抑制胃腸道運(yùn)動(dòng)及抑制細(xì)胞增殖［13，14］，還可能通過(guò)保護(hù)谷胱甘肽還原酶活性以維持胃黏膜內(nèi)非蛋白結(jié)合疏基含量，從而防止細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)胃黏膜。近年來(lái)，SS及其類似物在臨床廣泛應(yīng)用，不僅可以用于內(nèi)分泌腫瘤的治療，而且對(duì)胃腸道腫瘤及胃腸出血等疾病都有較好的治療效果，是胃黏膜細(xì)胞和胃腸黏膜屏障重要的保護(hù)性因素［15］。

在本實(shí)驗(yàn)中，CAI組胃竇黏膜中SS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較SC組減少，這與謝勇等［16］的報(bào)道一致。表明乙醇可破壞D細(xì)胞或抑制SS的分泌。SS水平削弱了其對(duì)胃泌素和胃酸分泌的抑制作用，以及對(duì)上皮細(xì)胞和黏膜的保護(hù)作用，加重胃黏膜的損傷。

葛根為常用中藥，是豆科植物野葛或干葛藤的干燥根，始載于神農(nóng)本草經(jīng)，被列為中品，有山人參的美稱;葛根性平，味甘辛，具有發(fā)表解肌、開(kāi)陽(yáng)透疹、解熱生津等作用。葛根解酒主要是因?yàn)楦鸶幸胰┟摎涿赋煞郑捎糜谥委熞掖家蕾嚭鸵掖冀鋽喟Y狀［17］。乙醇中毒或酗酒的治療主要是通過(guò)乙醛脫氫酶抑制劑產(chǎn)生一定的乙醛，造成人體不適而減少乙醇的攝入或戒酒。Benlhabib等［18，19］研究發(fā)現(xiàn)，葛根所含主要物質(zhì)葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮成分可明顯抑制乙醇喜愛(ài)型大鼠的乙醇攝入和減輕戒斷癥狀。目前臨床使用的葛根素是從葛根中提取分離出來(lái)的一種單體，屬異黃酮類化合物，具有抗缺血再灌注損傷、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等多種藥理作用，適用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗死等疾病［20］。王福文等［21］研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可以明顯減輕浸水應(yīng)激所引起的大鼠胃黏膜損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)預(yù)先進(jìn)行葛根素處理后再行乙醇灌胃的小鼠，其胃竇黏膜內(nèi)的Gas、SS陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量較CAI組有明顯改變，SS陽(yáng)性細(xì)胞水平接近于SC組，SS分泌增加，激活其對(duì)機(jī)體的保護(hù)功能，從而抑制Gas陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和胃酸的分泌。本研究提示，葛根素通過(guò)引起乙醇性胃黏膜損傷時(shí)Gas、SS表達(dá)的改變，參與乙醇對(duì)胃竇黏膜產(chǎn)生損傷的調(diào)節(jié)，對(duì)乙醇性胃黏膜損傷有保護(hù)作用。

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