丙泊酚對大鼠缺氧后海馬細胞谷氨酸轉運蛋白表達及其功能的影響

鄭玉珍，閆 諾，張 彥，梁 禹

(1天津市環湖醫院，天津300060;2天津武警醫學院附屬醫院)

谷氨酸是中樞神經系統主要的興奮性氨基酸遞質，經突觸前膜釋放至突觸間隙，然后作用突觸后膜受體發揮生理效應。生理狀態下，突觸周圍膠質細胞谷氨酸轉運蛋白可攝取突觸間隙過多的谷氨酸以補充谷氨酸循環。有研究顯示在創傷、腦卒中等病理狀態下，膠質細胞轉運蛋白轉錄及表達降低［1］，攝取功能障礙，造成大量谷氨酸在突觸間隙聚集，頻繁誘發突出后興奮性電位，引起神經細胞興奮性神經損傷。丙泊酚是一種靜脈麻醉藥，可通過多種機制發揮腦保護作用。但是，丙泊酚是否通過調節谷氨酸轉運蛋白(EAAT)的表達和降低缺氧后興奮性神經毒性損傷發揮腦保護作用，尚無文獻報道。2011年8月～2013年2月，我們就丙泊酚對缺氧后EAAT表達和谷氨酸攝取的影響進行研究，以進一步探討缺氧后丙泊酚的腦保護作用機制。

1 材料與方法

1．1 細胞培養及分組 參照Velly等［2］方法，無菌條件下取10個月齡SD大鼠的海馬組織，去除腦膜和血管，用0．25%胰蛋白酶消化成細胞懸液后，接種到預先用多聚賴氨酸0．1 g/L處理24 h的培養瓶內，24 h后更換培養基，以后3 d更換1次培養基。第7天時，放入恒溫搖床內，100 r/min振搖5 h;棄去培養基，用0．5%的胰蛋白酶消化吹勻后，接種于培養板中，待長成連續單層后，按試驗需要分為對照組和丙泊酚組，每組6個復孔，繼續培養7 d進行缺糖/缺氧模型制作。對照組:用無糖Earles培養液，置于37℃、5%CO2氮氣缺氧罐中缺糖/缺氧培養6 h。丙泊酚組:換以含丙泊酚的無糖Earles培養液，置于37℃、5%CO2氮氣缺氧罐中缺糖/缺氧培養6 h。然后分別收集細胞進行相關實驗。

1．2 EAAT2測定 將上述各組細胞取出，用不含藥物的人工腦脊液灌流10 min，Western blot方法進行EAAT2蛋白測定。然后根據廠家試劑盒指示提取細胞總RNA，參照 Su等［3］方法取總RNA 20μg進行Nothern blot測定，其值用測定蛋白/內對照灰度值表示。

1．3 NF-κB寡核苷酸(ODN)的建立及細胞核NF-κB蛋白測定 反義 ODN系列為 5＇-GGGGAA CAGTTCGTCCATGGC-3＇，正義 ODN 序列為 5＇-GCCATGGACGAACTGTTCCCC-3＇。ODN均經全程硫代化修飾，上海博亞生物工程公司合成，經PAGE方法純化，用脂質體法將反義ODN和正義ODN對各組培養細胞進行轉染，然后提取細胞核蛋白，用Western blot方法進行NF-κB和EAAT2蛋白測定，其值用測定蛋白/內對照灰度值表示。

1．4 谷氨酸攝取量的測定 細胞培養基中加入3HD-L-Glu共同孵育15 min后，用冰冷的0．9%NaCl溶液終止反應并沖洗3遍，隨即加入0．3 mol/L NaOH溶液裂解細胞，最后離心，收集上清液加入閃爍液，使用液閃計數儀測定3H-D-L-Glu攝取率。

1．5 統計學方法 采用SPSS12．0統計學軟件，計量資料以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗和方差分析。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 缺氧海馬細胞EAAT2的表達 與對照組相比，丙泊酚組海馬細胞EAAT2蛋白、EAAT2 mRNA表達均明顯增加 (見圖1)。

圖1 丙泊酚對EAAT2表達的影響

2．2 丙泊酚對反義、正義 ODN處理后 NF-κB、EAAT2表達的影響 反義ODN處理后兩組細胞核內 NF-κB 均接近于無表達(0．10 ±0．02 vs 0．28 ±0．03，P ＞0．05);與對照組相比，丙泊酚可明顯抑制正義ODN處理后細胞核內NF-κB的表達(2．13±0．56 vs 1．02 ±0．15，P ＜0．05)。反義 ODN 處理后兩組EAAT2表達無統計學差別(1．98±0．45 vs 2．12 ±0．59，P ＞0．05);與對照組相比，正義 ODN處理后丙泊酚可明顯上調EAAT2蛋白表達(0．56±0．02 vs 1．29 ±0．76，P ＜0．05)。

2．3 丙泊酚對谷氨酸攝取率的影響 反義ODN處理后丙泊酚對谷氨酸攝取率無影響［(19．2±3．4)%vs(20．3 ±4．1)%，P ＞0．05］，而正義 ODN處理后丙泊酚可明顯增強谷氨酸攝取率［(8．2±1．6)%vs(17．8 ±5．1)%，P ＜0．01］。

3 討論

研究表明，丙泊酚可上調細胞膜 EAAT3表達［4］，通過抗脂質過氧化發揮腦保護作用;然而體外實驗證實，臨床相關劑量丙泊酚并不能抑制缺血再灌注后脂質過氧化。Ansley等［5］觀察到大劑量丙泊酚僅可抑制50%的脂質過氧化程度，因此，臨床劑量丙泊酚通過EAAT3發揮腦保護作用受到了質疑。

谷氨酸介導的興奮性神經毒性損傷于缺血后可迅速發生，過去嘗試用各種方法減低谷氨酸興奮性毒性損傷。臨床實驗中首先應用的是NMDA拮抗劑，結果顯示該方法拮抗病理突觸過度興奮傳遞的同時阻礙了生理突觸傳導通路，反而加速神經元細胞死亡。另一重要方法是通過EAAT攝取突觸間隙過多的谷氨酸，降低細胞外谷氨酸濃度從而減小神經毒性損傷。因此，EAAT表達及功能研究成為近些年來研究的熱點。本文就丙泊酚處理對缺氧后海馬細胞谷氨酸毒性損傷的影響是否與EAAT2的雙向調節有關，進行了研究，結果顯示缺氧后丙泊酚處理可上調EAAT2基因和蛋白的表達，提高谷氨酸攝取率，因此丙泊酚缺血后處理可能通過正向調節EAAT2表達及增強其功能發揮腦保護作用。

已有研究證實，基因轉錄［6］或翻譯過程調節［7］可增強EAAT2蛋白表達。本研究結果顯示，丙泊酚可通過基因轉錄調節EAAT2的表達。低氧環境下HIF是細胞核內主要的調節因子。Dallas等［8］研究發現，HIF活性抑制劑topotecan、FG4496和DFO不能上調EAAT2表達，而NF-κB活性抑制劑可逆轉缺氧對EAAT2表達的抑制，增強谷氨酸攝取率。NF-κB是p65和p50組成的異質二聚體，靜態下與NF-κB抑制劑(IκB)結合存在于細胞質內，缺血再灌注損傷或缺氧應激等刺激可促進IκB磷酸化同時解除對NF-κB的抑制，NF-κB可從細胞質轉移至細胞核調節與炎癥反應，細胞存活、分化、增殖、血管形成等有關的基因轉錄。NF-κB在缺血腦損傷中發揮重要調節作用。Wang等［9］制作大鼠缺血再灌注模型，將IκB突變重組腺病毒(AdIκBaM)和野生型重組腺病毒轉染皮層組織，結果發現AdIκBaM可明顯抑制缺血后腦損傷。也有研究表明，NF-κB作為促死因子加重缺氧后的神經細胞死亡［10］。然而Sitcheran等［11］提出缺血再灌注損傷后 NF-κB也可作用于EAAT2啟動子，正向或反向調節細胞外谷氨酸濃度，促進缺血后細胞存活或加重神經毒性損傷［12］。為了觀察NF-κB是否參與丙泊酚處理后的EAAT調節，我們將NF-κB反義ODN和正義ODN分別加入各組培養細胞培養24 h后觀察EAAT2的表達。結果顯示反義ODN處理后兩組NF-κB均無表達，正義ODN處理后對照組NF-κB表達明顯增強，丙泊酚可抑制NF-κB的表達，與反義ODN相比，正義ODN處理可使EAAT2的表達明顯減弱，說明NF-κB可負向調節EAAT2的表達，而缺氧后丙泊酚處理可逆轉NF-κB的負向調節，從而促進EAAT2上調。此研究結果與Lee等［13］的結果相反，可能與本研究選用的是無氧培養細胞有關。

綜上所述，缺氧后丙泊酚處理可通過NF-κB通路上調海馬細胞EAAT2的表達，提高谷氨酸攝取率，降低興奮性神經毒性損傷，這可能是丙泊酚發揮腦保護的主要機制。

［1］Barreto G，White RE，Ouyang Y，et al．Astrocytes:targets for neuroprotection in stroke［J］．Cent Nerv Syst Agents Med Chem，2011，11(2):164-173．

［2］ Velly LJ，Guillet BA，Masmejean FM，et al．Neuroprotective effects of propofol in a model of ischemic cortical cell cultures:role of glutamate and its transporters［J］．Anesthesiology，2003，99(2):368-375．

［3］Su ZZ，Leszczyniecka M，Kang DC，et al．Insights into glutamate transport regulation in human astrocytes:cloning of the promoter for excitatory amino acid transporter 2(EAAT2)［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(4):1955-1960．

［4］Yun JY，Park KS，Kim JH，et al．Propofol reverses oxidative stress-attenuated glutamate transporter EAAT3 activity:evidence of protein kinase C involvement［J］．Eur JPharmacol，2007，22(1-3):83-88．

［5］Ansley DM，Lee J，Godin DV，et al．Propofol enhances red cell antioxidant capacity in swine and humans［J］．Can J Anaesth，1998，45(3):233-239．

［6］Kim K，Lee SG，Kegelman TP，et al．Role of excitatory amino acid transporter-2(EAAT2)and glutamate in neurodegeneration:opportunities for developing novel therapeutics［J］．JCell Physiol，2011，226(10):2484-2493．

［7］Colton CK，Kong Q，Lai L，et al．Identification of translational activators of glial glutamate transporter EAAT2 through cell-based high-throughput screening:an approach to prevent excitotoxicity［J］．J Biomol Screen，2010，15(6):653-662．

［8］Dallas M，Boycott HE，Atkinson L，et al．Hypoxia suppresses glutamate transport in astrocytes［J］．J Neurosci，2007，27(15):3946-3955．

［9］Wang R，Liang S，Yue H，et al．Using a novel in vivo model to study the function of nuclear factor kappa B in cerebral ischemic injury［J］．Med Sci Monit，2012，18(11):BR461-467．

［10］Nijboer CH，Heijnen CJ，Groenendaal F，et al．A dual role of the NF-kappaB pathway in neonatal hypoxic-ischemic brain damage［J］．Stroke，2008，39(9):2578-2586．

［11］Nurmi A，Lindsberg PJ，Koistinaho M，et al．Nuclear factor-kappaB contributes to infarction after permanent focal ischemia［J］．Stroke，2004，35(4):987-991．

［12］Vaibhav K，Shrivastava P，Javed H，et al．Piperine suppresses cerebral ischemia-reperfusion-induced inflammation through the repression of COX-2，NOS-2，and NF-κB in middle cerebral artery occlusion rat model［J］．Mol Cell Biochem，2012，367(1-2):73-84．

［13］Lee SG，Su ZZ，Emdad L，et al．Mechanism of ceftriaxone induction of excitatory amino acid transporter-2 expression and glutamate uptake in primary human astrocytes［J］．J Biol Chem，2008，283(19):13116-13123．