白血病干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的方法學(xué)探討

馮錫武，羅政委，魏 虹，農(nóng)衛(wèi)霞，周宗瑤

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，新疆石河子832000;2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

白血病是一類造血干細(xì)胞異常的惡性克隆性疾病，骨髓移植及造血干細(xì)胞的臨床應(yīng)用促進(jìn)了白血病及白血病干細(xì)胞(LSCs)的研究進(jìn)展。自從Bonnet等［1］確認(rèn) LSCs 存在于細(xì)胞群以后，LSCs的研究進(jìn)入了新的階段［2～4］等

陸續(xù)被證實(shí)是LSCs的表型，白血病造血干細(xì)胞移植也取得了越來(lái)越顯著的成就。盡管如此，造血干細(xì)

cell culture胞的體外培養(yǎng)擴(kuò)增方面仍然面臨很多困難。2011年12月～2013年2月，我們對(duì)LSCs和骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的方法學(xué)進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1．1 材料 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS公司)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，流式細(xì)胞儀(BD AriaIII)，超凈工作臺(tái)(Thermo公司)，L-DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS)(杭州四季青公司)，CD34-APC、CD38-FITC、CD123-PE熒光標(biāo)記抗體(Ebioscience公司)，注射用絲裂霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)，淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)，6/24孔培養(yǎng)板(Corning公司)。

1．2 方法

1．2．1 骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 采用人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法獲取白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，離心后離心管中液體明顯分為4～5層:紅細(xì)胞層、淋巴細(xì)胞分離液層、單個(gè)核細(xì)胞云霧狀層、血漿同稀釋液層(或者脂肪層)。提取單個(gè)核細(xì)胞云霧狀層，離心洗滌后加入含有10%FBS的RPMI-1640中吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度106/mL，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)板中培養(yǎng)。3 d后換液，將懸浮細(xì)胞分開(kāi)培養(yǎng)或凍存。

1．2．2 飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備及共培養(yǎng) 將第2代或第3代骨髓基質(zhì)細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板中，待基質(zhì)細(xì)胞達(dá)到80%融合度時(shí)，棄培養(yǎng)基，換用10μg/mL的絲裂霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 h，然后用PBS沖洗3～5次，盡量減少絲裂霉素對(duì)后續(xù)共培養(yǎng)的影響，添加新鮮培養(yǎng)基并將懸浮造血細(xì)胞轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)。原代共培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞不做任何處理，持續(xù)共培養(yǎng)。

1．2．3 細(xì)胞表面抗原標(biāo)志檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀，收集1×106以上細(xì)胞，PBS洗滌2次，分為5管，每管不少于200μL，密度不低于5×105/mL。一管不加熒光抗體作為陰性對(duì)照，三管分別加入不同標(biāo)記的熒光抗體作為單陽(yáng)對(duì)照，一管加入全部三種熒光抗體作為檢測(cè)管。4℃放置30 min，洗滌重懸后轉(zhuǎn)入流式管中，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

圖1 LSCs的表面標(biāo)記

2．2 基質(zhì)細(xì)胞同白血病細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果 增殖的細(xì)胞在一起排列生長(zhǎng)成細(xì)胞群(見(jiàn)圖2)。圖中箭頭所示為卵石樣區(qū)域細(xì)胞。具有自我更新能力的干細(xì)胞同基質(zhì)細(xì)胞黏附在一起，折光性變?nèi)?有一部分干細(xì)胞會(huì)通過(guò)基質(zhì)細(xì)胞之間的縫隙進(jìn)入基質(zhì)細(xì)胞層的下面［5］，找尋維持其干性的微環(huán)境。

圖2 基質(zhì)細(xì)胞同造血系統(tǒng)LSCs共培養(yǎng)鏡像

3 討論

干細(xì)胞的生存必須依賴其周圍的祖細(xì)胞、淋巴、巨噬、成纖維、內(nèi)皮和其他各類間充質(zhì)細(xì)胞分化構(gòu)成的微環(huán)境。CD+34細(xì)胞中95%以上是早期和晚期造血祖細(xì)胞，干細(xì)胞只是很小一部分［6］，這說(shuō)明了真正的干細(xì)胞比例是極其低的。

不論是正常造血干/祖細(xì)胞還是白血病干/祖細(xì)胞，它們的體外擴(kuò)增都是一個(gè)世界性難題。體外培養(yǎng)條件下，擴(kuò)增非常有限。骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以支持造血系細(xì)胞的增殖現(xiàn)在是一種共識(shí)，LSCs雖然是異常的造血系細(xì)胞，但是也離不開(kāi)基質(zhì)細(xì)胞等所營(yíng)造的微環(huán)境。上世紀(jì)90年代，科學(xué)家找到一系列細(xì)胞因子，如 SCF、FL、TPO、IL-6 和 IL-3，并發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞因子似乎可以促使造血干細(xì)胞在體外大量擴(kuò)增，但后來(lái)的實(shí)驗(yàn)研究證明，這些因子的主要作用是誘導(dǎo)造血干細(xì)胞分化成造血祖細(xì)胞，并最終分化成各類成熟的血細(xì)胞。也有研究顯示，SCF、FL、IL-3對(duì)LSCs的擴(kuò)增是無(wú)效的。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可以分化成多種基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)，然而通常情況下，因?yàn)闊o(wú)法確切地將兩者進(jìn)行區(qū)分，往往認(rèn)為它們代表了同一概念。但是，基質(zhì)細(xì)胞所涵蓋的范圍要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于間充質(zhì)干細(xì)胞。

裴雪濤［8］研究結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的BMSC表達(dá) IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、LIF、MCSF、Flt-3 配基和 SCF 的 mRNA。朱光榮等［9～10］也證實(shí)TPO表達(dá)于MSCs。將CD+34造血干/祖細(xì)胞分別與骨髓MSC和BMSC共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，BMSC能夠更有效地支持造血干/祖細(xì)胞的分化［11］。此外，細(xì)胞外基質(zhì)在造血細(xì)胞擴(kuò)增及LTC-IC的維持中也起著重要的作用［12］。本結(jié)果同上述研究基本一致。絲裂霉素處理的傳代骨髓基質(zhì)細(xì)胞，不能夠再增殖、分化，只能夠短暫地分泌一些細(xì)胞因子。而未經(jīng)處理的原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞，很好地保存了骨髓中的各種貼壁性細(xì)胞并能夠分泌更多種類的細(xì)胞因子;長(zhǎng)期培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞分泌的基質(zhì)也可以結(jié)合一些細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子，從而營(yíng)造更接近體內(nèi)的造血微環(huán)境。雖然不能通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)記簡(jiǎn)單地將LSCs同造血干細(xì)胞明確一分為二，但是在超出正常水平細(xì)胞量的情況下，可以認(rèn)為檢測(cè)到的干/祖細(xì)胞中絕大部分是白血病干/祖細(xì)胞。

本研究顯示，部分白血病細(xì)胞在原代共培養(yǎng)中能夠長(zhǎng)期存活，并且不間斷地有細(xì)胞團(tuán)的產(chǎn)生，表明原代共培養(yǎng)可以更好地?cái)U(kuò)增 LSCs。這些研究為L(zhǎng)SCs的培養(yǎng)找到了一種經(jīng)濟(jì)可行的方法，也為進(jìn)一步研究LSCs提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)。

［1］Bonnet D，Dick JE．Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell［J］．Nat Med，1997，3(7):730-737．

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［4］肖平，曾耀英，林蔚．白血病干細(xì)胞相關(guān)抗原在急性白血病細(xì)胞中的表達(dá)［J］．中華實(shí)用診斷與治療雜志，2011，25(12):1179-1181．

［5］Jing D，F(xiàn)onseca AV，Alakel N．et al．Hematopoietic stem cells in co-culture with mesenchymal stromal cells-modeling the niche compartments in vitro［J］．Haematologica，2010，95(4):542-550．

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［7］Jordan CT，Upchurch D，Szilvassy SJ．et al．The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells［J］．Leukemia，2000，14(10):1777-1784．

［8］裴雪濤．干細(xì)胞技術(shù)［M］．北京:化學(xué)工業(yè)雜志社，2002:37-38．

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［11］韓忠朝．間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)及臨床［M］．北京:科學(xué)出版社，2012:249-250．

［12］郝玉書(shū)，肖志堅(jiān)．白細(xì)胞疾病基礎(chǔ)理論與臨床［M］．上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006:4-6．