C1QBP在單核細胞THP-1趨化運動中的作用

岳 丹，苑 博，齊 燦，馮香梅，劉運德，王 勇，

(1天津醫科大學醫學檢驗學院，天津300203;2天津醫科大學第二醫院)

趨化運動是指細胞能夠感受到環境中化學分子的濃度梯度，并沿著濃度梯度的方向所做的定向運動［1］，它與機體的免疫應答及腫瘤轉移等密切相關。C1QBP是一種多功能伴侶蛋白，廣泛分布于線粒體、細胞核、細胞質、高爾基體及細胞膜上，并能夠被分泌到細胞外基質中，其生理功能可能包括參與細胞內分子運輸、連接不同細胞器以及細胞器和細胞膜之間的信號傳導［2］。為探討炎癥性疾病的發病機制和腫瘤治療的理論依據，2011年3月～2013年6月，我們對C1QBP在單核細胞中的表達及對細胞趨化運動的影響進行了研究。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細胞株 人急性單核白血病細胞(THP-1)，小鼠白血病巨噬細胞(RAW264．7)和人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)均購自美國ATCC細胞庫;THP-1細胞用RPMI-1640培養基，RAW264．7和MDA-MB-231細胞用DMEM培養基。

1．1．2 試劑及抗體 Lipofectamine2000購自 Invitrogen公司，CSF-1購自美國BD公司，趨化小室、聚碳酸脂膜購自Neuro Probe公司，纖連蛋白(Fibronectin)購自Sigma公司，BCA測定試劑盒購自Pierce公司，C1QBP抗體、PKCζ抗體、β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的IgG二抗均購自美國Santa Cruz公司，鬼筆環肽(phalloidin)購自 Molecular Probe公司，蛋白A瓊脂糖(Protein A Agarose)和蛋白G瓊脂糖(Protein G Agarose)購自Invitrogen公司，其他試劑均為國產分析純產品。

1．2 方法

1．2．1 C1QBP、PKCζ在細胞中的表達檢測 預冷的1×SDSlysis buffer(或RIPA裂解液)裂解細胞，提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。取30μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，半干轉印法將凝膠上的蛋白轉印至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h，兔源抗C1QBP、PKCζ、鼠源抗βactin一抗4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標記的IgG二抗室溫孵育1 h，ECL化學發光法顯影。

1．2．2 siRNA有效序列篩選 人 C1QBP特異性Stealth-TM RNAi由Invitrogen公司設計合成。將細胞鋪于6孔板中，待細胞30% ～50%融合時，換成無雙抗無血清培養液。將 5μL(100 pmol)的StealthTM RNAi加入250μL的Opti-MEM無血清培養基中，輕輕混勻;將5μL的Lipofectamine 2000加入250μL的Opti-MEM無血清培養基中，輕輕混勻;室溫靜置孵育5 min。將上述液體混勻，室溫靜置孵育20 min;將6孔盤中的培養液棄去，加入1．5 mL的無雙抗含血清培養基;將上述混合液加入培養板中，放入37℃、5%CO2培養箱中培養。

1．2．3 C1QBP表達對細胞趨化運動能力影響的檢測 集落刺激因子(CSF-1)用0．1%BM稀釋濃度至1、10、50、100 ng/mL，置于趨化小室的下室，30 μL/孔，只加0．1%BM的孔作為陰性對照;調整細胞濃度為5×105/mL，50μL/孔，加于趨化小室的上室;將10μg/mL Fibronectin包被的5μm孔徑的聚碳酸酯膜置于趨化小室的上下室之間。趨化小室在37℃、5%CO2的孵化箱中孵育3 h;聚碳酸酯膜用PBS清洗，將沒穿過膜的細胞刮除洗掉，穿過膜的細胞固定、染色，在倒置顯微鏡下計數穿過膜的細胞數，每孔至少隨機選取3個視野。

1．2．4 C1QBP表達對細胞聚合能力影響的檢測細胞提前饑餓3 h，將細胞提前鋪于6孔板中，3×105/孔，用50 ng/mL的CSF-1刺激細胞。冰PBS終止反應，用3．7%多聚甲醛固定10 min。用含0．2%Triton X-100的F-buffer作用20 min，F-buffer快速洗滌。室溫下用FITC-conjugated phalloidin避光孵育細胞1 h，用F-buffer洗滌，加入甲醇萃取phalloidin，4℃萃取1 h。將甲醇吸入96孔板中，細胞用F-buffer洗滌，提取蛋白，BCA法在562 nm波長下測定蛋白濃度。

1．2．5 C1QBP與PKCζ的相互作用檢測 培養的細胞用冰PBS洗3次，加入預冷的細胞裂解液在冰上晃動30 min，用細胞刮刮取，收集細胞裂解液，12 000 r/min、4℃、離心15 min。每管吸取上清液50～100μL作為Input。將剩余的上清液吸入細胞裂解液預洗過的Protein A或Protein G Agarose中做預清除，以去除非特異結合的蛋白。在4℃搖床上反應1 h，快速離心20～30 s，吸取上清，加入相應的抗體及同源的對照抗體IgG，4℃搖床上反應2 h;加入新的預處理過的Protein A或Protein G Agarose在4℃搖床上反應1 h;快速離心，棄上清，用裂解液洗滌Protein A或Protein G Agarose。加入1×loading buffer 50～100μL，同時將 Input加入5×loading buffer，95°C煮10 min使蛋白變性;將上清液吸入新的EP管中，進行Western blot檢測。

1．2．6 統計學方法 采用SPSS11．0統計軟件，選用方差分析或t檢驗對數據行統計學處理。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 C1QBP及 PKCζ在細胞中的表達 C1QBP、PKCζ在 THP-1、RAW264．7、MDA-MB-231 三種細胞系中均有較高表達(圖1)。

圖1 C1QBP 及 PKCζ在 THP-1、RAW264．7、MDA-MB-231細胞中的表達

2．2 C1QBP表達對THP-1細胞趨化運動的影響采用siRNA技術降低THP-1細胞中C1QBP蛋白的表達，篩選該蛋白表達量降低的有效序列為1和3(圖2)。顯示C1QBP表達下調可以明顯抑制THP-1細胞的趨化運動(P＜0．01)(圖3)。

2．3 C1QBP表達對THP-1細胞聚合能力的影響C1QBP表達降低導致CSF-1誘導的F-actin聚合能力降低(圖4)。

2．4 C1QBP與PKCζ的相互作用 經CSF-1刺激THP-1細胞后提取總蛋白，免疫共沉淀實驗發現C1QBP與PKCζ可以相互作用(圖5)。

3 討論

圖2 C1QBP蛋白表達量降低的有效序列

圖3 C1QBP表達下降對THP-1趨化運動的影響

圖4 THP-1中C1QBP表達下降對CSF-1誘導的F-actin聚合能力的影響

圖5 C1QBP與PKCζ在THP-1中的相互作用

機體在病毒、細菌脂多糖等外源性或白細胞介素、腫瘤壞死因子、干擾素等內源性炎癥因子刺激下產生大量的趨化因子，趨化單核/巨噬細胞到達炎性部位并活化，因此單核/巨噬細胞趨化運動在抵御病原體感染過程中發揮著關鍵作用［3］。巨噬細胞入侵對腫瘤的發展和轉移起著重要的作用。在腫瘤形成之前常有大量的巨噬細胞和其他炎癥細胞在腫瘤原位聚集，慢性炎癥可加重病灶部位的巨噬細胞聚集，這些炎癥細胞可被反復激活并釋放活性氧，造成組織細胞損傷、轉化以致癌變［4］。腫瘤中表達的CSF-1能加快單核/巨噬細胞向腫瘤組織的趨化［5］，動物實驗也證實抑制巨噬細胞向腫瘤聚集可以明顯抑制腫瘤的生長和轉移［4，6］。目前，細胞趨化運動的調控機制尚待完善，闡明單核細胞趨化運動的分子機制，對炎性疾病及腫瘤治療具有重要意義。細胞的趨化運動需要很多蛋白分子參與，它們分布于細胞的不同位置，發揮各自不同的作用。如果抑制某一個或幾個分子的活化過程，勢必會直接或間接影響細胞的趨化運動能力。C1QBP是一種多功能伴侶蛋白，其詳細的生理功能還不是很清楚。C1QBP與透明質酸相互作用，促使細胞間黏附和去黏附的產生，并參與了染色體的組建［7］;與Clq結合調節淋巴細胞增殖［8］;與 ASF/SF2結合，調節前mRNA的剪接［9］。最近的研究表明，線粒體中的p32還參與了ARF誘導的細胞凋亡以及維持腫瘤細胞的氧化磷酸化［10，11］。本研究利用小RNA干擾技術降低 THP-1細胞 C1QBP的表達，首次發現C1QBP表達沉默可抑制THP-1細胞的趨化運動，降低F-actin聚合能力。因此我們認為C1QBP在調節THP-1細胞的趨化運動中起重要作用。

PKCζ的12種亞型構成了一個絲氨酸/蘇氨酸激酶超家族，是細胞內重要的信號傳導分子，參與調節細胞的增殖、生長及凋亡。此外，PKCζ還參與了細胞骨架重排、細胞的極化、分化、運動和腫瘤轉移等［12］。研究發現，PKCζ在調節腫瘤及單核/巨噬細胞的趨化運動中起重要的作用;PKCζ通過調節肌動蛋白的聚合參與了巨噬細胞的趨化運動，PKCζ降表達可以抑制CSF-1誘導的巨噬細胞趨化運動，同時也抑制MCP-1誘導的巨噬細胞趨化運動［13～15］。因此，PKCζ是G蛋白偶聯受體和酪氨酸激酶受體所誘導的信號通路中一個共用的信號分子，同時也是細胞趨化運動途徑中的關鍵分子。

研究發現，活化的PKCζ與p32在體外結合明顯增強，p32可能在PKCζ轉位及功能的調節方面起重要作用［16］。近期有研究證實，p32參與調節PKCζ從細胞質向細胞膜轉位后，p32、PKCζ和mL-gl2蛋白結合形成暫時的三元絡合物，PKCζ被激活，進一步磷酸化 mLgl2蛋白，繼而調節細胞的極性［17］。在單核/巨噬細胞中，C1QBP與 PKCζ的相互作用尚無報道。本研究利用免疫共沉淀實驗發現C1QBP與PKCζ之間存在相互作用。進一步探討二者之間的相互作用機制，可能對揭示單核/巨噬細胞趨化運動中的調節機制有重要意義。

［1］Devreotes PN，Zigmond SH．Chemotaxis in eukaryotic cells:a focus on leukocytes and Dictyostelium［J］．Annu Rev Cell Biol，1998，4:649-686．

［2］Ghosh I，Chattopadhaya R，Kumar V，et al．Hyaluronan binding protein-1:a modulator of spermoocyte interaction［J］．Soc Reprod Fertil Suppl，2007，63:539-543．

［3］Hamilton JA，Tak PP．The dynamics of macrophage lineage populations in inflammatory and autoimmune diseases［J］．Arthritis Rheum，2009，60(5):1210-1221．

［4］Qian BZ，Pollard JW．Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis［J］．Cell，2010，141(1):39-51．

［5］Porta C，Riboldi E，Sica A．Mechanisms linking pathogens-associated inflammation and cancer［J］．Cancer Lett，2011，305(2):250-262．

［6］Qian B，Deng Y，Im JH，et al．A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation，establishment and growth［J］．PLoSOne，2009，4(8):e6562．

［7］Sengupta A，Banerjee B，Tyagi RK，et al．Golgi localization and dynamics of hyaluronan bindingprotein 1(HABP1/p32/C1QBP)during the cell cycle［J］．Cell Res，2005，15(3):183-186．

［8］Ghebrehiwet B，Peerschke EI．cC1q-R(calreticulin)and gC1q-R/p33:ubiquitously expressed multi-ligand binding cellular proteins involved in inflammation and infection［J］．Mol Immunol，2004，41(2/3):173-183．

［9］Petersen-Mahrt SK，Estmer C，Ohrmalm C，et al．The splicing factor-associated protein，p32，regulates RNA splicing by inhibiting ASF/SF2 RNA binding and phosphorylation［J］．EMBO J，1999，18(4):1014-1024．

［10］ Fogal V，Richardson AD，Karmali PP，et al．Mitochondrial p32 protein is a critical regulator of tumor metabolism via maintenance of oxidative phosphorylation［J］．Mol Cell Biol，2010，30(6):1303-1318．

［11］Itahana K，Zhang Y．Mitochondrial p32 is a critical mediator of ARF-induced apoptosis［J］．Cancer Cell，2008，13(6):542-553．

［12］Sheinerman FB，Giraud E，Laoui A．High affinity targets of protein kinase inhibitors have similar residues at the positions energetically important for binding［J］．JMol Biol，2005，352(5):1134-1156．

［13］Guo H，Gu F，Li W，et al．Reduction of protein kinase Czeta inhibitsmigration and invasion of human glioblastoma cells［J］．J Neurochem，2009，109(1):203-213．

［14］Guo H，Ma Y，Zhang B，et al．Pivotal Advance:PKCzeta is required for migration of macrophages［J］．J Leukoc Biol，2009，85(6):911-918．

［15］Zhang B，Ma Y，Guo H，et al．Akt2 is required for macrophage chemotaxis［J］．Eur J Immunol，2009，39(3):894-901．

［16］ Robles-Flores M，Rendon-Huerta E，Gonzalez-Aguilar H，et al．p32(gC1qBP)is a general protein kinase C(PKC)-binding protein;interaction and cellular localization of P32-PKCζcomplexes in ray hepatocytes［J］．JBiol Chem，2002，277(7):5247-5255．

［17］Bialucha CU，Ferber EC，Pichaud F，et al．p32 is a novel mammalian Lgl binding protein that enhances the activity of protein kinase Czeta and regulates cell polarity［J］．J Cell Biol，2007，178(4):575-581．