斑蝥酸鈉維生素B6對人肝星狀細胞增殖的影響及其機制

牛麗娟，李 濤，賀麗珠，關麗云，田金飛，馬國剛

(1石家莊市第三醫(yī)院，石家莊050017;2河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學教研室)

斑蝥素是一種半帖烯毒素，斑蝥酸鈉是斑蝥素與氫氧化鈉共熱時水解生成的一種半合成藥物，其毒性和刺激性都比斑蝥素低［1］。斑蝥酸鈉維生素B6注射液是由斑蝥酸鈉和維生素B6配制而成的合成藥物。研究顯示，該藥物對多種腫瘤(如肝癌、胃癌等)和肝纖維化都有良好的療效［2～4］，但尚未見其對肝星狀細胞影響的報道。肝星狀細胞的活化是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，如何減少肝星狀細胞的活化和增殖已成為抗肝臟纖維化研究的熱點。2012年5月～2013年1月，我們就斑蝥酸鈉維生素B6對人的肝星狀細胞LX-2增殖的影響以及相關基因的表達變化進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料 斑蝥酸鈉維生素B6注射液購自貴州柏強制藥有限公司;胎牛血清及高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;胰酶、MTT、RNA提取試劑盒Trizol購自上海生工公司;RT-qPCR擴增系統(tǒng)購自美國Promega公司;PCR引物采用Primer5.0自行設計并由華大基因公司合成;人肝星狀細胞LX-2購自中南大學湘雅醫(yī)學院細胞中心。主要儀器有超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、Rotor-Gene6000熒光定量PCR儀等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肝星狀細胞LX-2用含12%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下孵育培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 細胞增殖檢測 采用MTT法，將對數(shù)生長期LX-2細胞以每孔6×104個接種于96孔板，在37℃、5%CO2條件下孵育，24 h后換無血清DMEM培養(yǎng)液37℃再孵育24 h，使細胞基本同步化G0期后再分1、5、10μg/mL斑蝥酸鈉維生素B63個觀察組和1個空白對照組。培養(yǎng)24、48、72 h后，在每孔加入20μL MTT溶液(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)液，然后每孔加入150μL二甲基亞砜，振蕩15 min，使結(jié)晶充分溶解。同時設置調(diào)零孔，在酶聯(lián)免疫檢測儀波長490 nm處測量各個孔的吸光度(OD)值。細胞生長抑制率(%)=(1－觀察組OD值/空白對照組OD值)×100%。

1.2.3 Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、轉(zhuǎn)化生長因子 β1(TGF-β1)基因mRNA表達檢測 采用RT-qPCR方法，用10μg/mL斑蝥酸鈉維生素B6作用細胞72 h后，按RNA提取試劑盒要求提取細胞RNA，取1μg總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將cDNA按以下反應體系:1μL cDNA、1μL上游引物、1μL下游引物、10μL預混的PCR反應緩沖液，7μL雙蒸水在熒光定量PCR儀上進行擴增。循環(huán)條件為94℃ 5 min，94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s共35個循環(huán)。引物序列為內(nèi)參GAPDH，上游引物5'-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3'、下游引物 5'-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3'。TGF-β1上游引物5'-ACAGCAACAATTCCTGGCGATAC-3'、下游引物5'-GCTAAGGCGAAAGCCCTCAAT-3'。Ⅰ型膠原上游引物5'-CCCAGCCACAAAGAGTCTACAT-3'、下游引物5'-TCATGGTACCTGAGGCCGTT-3'。Ⅲ型膠原上游引物 5'-CGCCCTCCTAATGGTCAAGG-3'、下游引物5'-TTCTGAGGACCAGTAGGGCA-3'。擴增產(chǎn)物均跨越內(nèi)含子，以防止基因組DNA的擴增。熒光定量PCR中每個樣本重復3次，取平均值為Ct值(為熱循環(huán)儀中熒光達到熒光閾值的循環(huán)數(shù))，采用相對定量2－ΔΔCt法比較目的基因表達變化。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間LX-2細胞抑制率 斑蝥酸鈉維生素B6注射液對LX-2細胞的增殖抑制作用隨作用時間的延長和藥物濃度的增加而增強。見表1。

表1 各組不同時間LX-2細胞抑制率比較(%，ˉx±s)

2.2 10μg/mL組72 h后Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1mRNA表達 見表2。

表2 10μg/mL組72 h后Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1 mRNA表達(ˉx±s)

3 討論

慢性肝病是嚴重危害人類健康的一類疾病，而肝纖維化是慢性肝病發(fā)展過程中一個共同的病理改變。肝纖維化是指各種病因所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導致肝內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)過度沉淀的病理過程。肝星狀細胞的活化增殖、TGF-β1水平變化在肝纖維化形成過程中起極其重要的作用，多種細胞均可合成分泌TGF-β1，尤其是肝星狀細胞。TGF-β1又可通過自分泌和旁分泌方式反作用于肝星狀細胞表面的 TGF-β1受體，通過 TGF-β1通路刺激Ⅰ、Ⅲ型膠原大量合成、分泌，造成肝纖維化的形成［5］。因此，抗纖維化治療的目的就是要抑制星狀細胞的活化和增殖，進而抑制細胞外基質(zhì)的產(chǎn)量，因此誘導活化的肝星狀細胞凋亡是抗肝纖維化的一種有效途徑。

斑蝥酸鈉具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、升高白細胞、抗組織纖維化的作用。已有研究證實，斑蝥酸鈉對腎臟纖維化有治療作用［4］，但其對肝纖維化的作用尚未見報道。本研究應用MTT法檢測斑蝥酸鈉對LX-2增殖的影響，將不同濃度的斑蝥酸鈉分別作用于LX-2細胞24、48、72 h后，顯示斑蝥酸鈉對LX-2的增殖有抑制作用，其抑制作用具有一定的時間劑量關系。與國內(nèi)外文獻報道相對細胞生長影響結(jié)果相一致［6、7］。TGF-β1是肝星狀細胞自分泌擴增的重要細胞因子，既增加膠原的合成，又進一步刺激TGF-β1的產(chǎn)生，使更多靜止的肝星狀細胞被激活。TGF-β1信號通路在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中的作用已經(jīng)被很多研究所證實［8、9］。我們采用熒光定量PCR的方法從mRNA水平檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β1基因表達變化，發(fā)現(xiàn)斑蝥酸鈉可以抑制TGF-β1的產(chǎn)生，阻斷自分泌放大過程，從而減少Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成。故斑蝥酸鈉可能通過TGF-β1信號通路抑制肝星狀細胞的活化和增殖，減輕肝纖維化。

綜上所述，斑蝥酸鈉能抑制人肝星狀細胞LX-2的活化和增殖，其機制可能與其干擾TGF-β1信號通路有關。其具體的分子機制還需進一步研究。

［1］Shi J，Wei SJ，Shan BE.Clinical observation on treatment of cancerous hydrothorax by Aiyishu injection［J］.Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine，2005，25(5):451-453.

［2］梁楓，王明艷，許冬青.斑蝥酸鈉誘導人胃癌細胞凋亡的實驗研究［J］.南京中醫(yī)藥大學學報，2006，22(3):171-172.

［3］許文會，趙浩亮，魏文貴，等.斑蝥酸鈉對人肝癌細胞的增殖作用及血管內(nèi)皮生長因子表達的影響［J］.中國醫(yī)療前沿，2012，7(4):4-5.

［4］Anna A，Antonella B，Lidia DB，et al.Caspase-dependent alteration of the ADP/ATPtranslocator triggers the mitochondrial permeability transition which is not required for the low-potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells［J］.J Neurochemistry，2006，97(4):1166-1181.

［5］Friedman SL.Mechanisms of Hepatic Fibrogenesis［J］.Gastroenterology，2008，134(6):1655-1669.

［6］常城，朱尤慶，梅娟娟.去甲斑蝥素對人肝癌HepG2細胞生長抑制作用的實驗觀察［J］.實用癌癥雜志，2010，25(5):450-452.

［7］成浩，范躍祖.去甲斑蝥素對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響及其機制探討［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2008，16(4):527-530.

［8］Inagaki Y，Okazaki I.Emerging insights into transforming growth factor beta Smad signal in hepatic fibrogenesis［J］.Gut，2007，56(2):284-292.

［9］Meindl-beinker NM，Dooley S.Transforming growth factor-b and hepatocyte transdifferentiation in liver fibrogenesis［J］.JGastroenterol Hepatol，2008，23(Suppl):S122-127.