節律基因Bmal1對胃癌細胞BGC-823增殖及凋亡的影響

魏 柏，熊枝繁，陳景三

(華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院，武漢430077)

生物節律的產生依賴于Bmal1、Clock等節律基因的調節［1，2］，Bmal1 作為生物鐘體系的核心基因，其突變后可引起生物節律體系的紊亂，甚至導致腫瘤的發生［3］。目前已經證實，胃腸道上皮細胞有節律基因的表達，但尚不明確Bmal1在胃癌中的作用。2012年1～7月，本研究利用RNA干擾技術靶向沉默Bmal1的表達，并觀察其對胃癌細胞BGC-823增殖及凋亡的影響?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞BGC-823購自武漢大學，Dulbecco's modified Eagle medium 購自 Hyclone，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，DEPC購自Sigma公司，Trizol、M-MLV逆轉錄酶、Tag DNA聚合酶購自Invitrogen公司，shRNA及相關引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司，流式細胞儀 FACSCalibur為 BD Biosciences，ABI7900型熒光定量 PCR儀為illumine eco，cDNA第一鏈合成試劑盒及SYBR Green Mix購自Fermentas，BCA蛋白濃度測定試劑盒、PMSF和RIPA裂解液購自碧云天生物技術有限公司，Bax一抗購自Epitomics，Bcl-2 一抗購自 Bioworld，Bmal1、c-Myc、CyclinD1和Wee1一抗購自Santa Curz，HRP標記二抗購自博士德生物工程有限公司，ECL底物液購自Thermo公司，X膠片購自科達公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及shRNA構建 胃癌細胞BGC-823用含10%胎牛血清DMEM培養液，在37℃、50 mL/L CO2濃度、飽和濕度下培養。shRNA目標基因為 5'-GCAGAATGTCATAGGCAAGTT-3'、5'-AACTTGCCTATGACATTCTGC-3'。細胞貼壁生長于6孔培養板上，用脂質體介導轉染胃癌細胞BCG-823。實驗分為轉染組和對照組(空白組)，G418篩選3周，挑取單克隆并擴大培養。轉染率由流式細胞術檢測。

1.2.2 克隆形成實驗 用0.25%胰蛋白酶溶液消化并吹打成單細胞懸液，懸浮在含10%小牛血清的培養液中備用;按每皿250個細胞的密度接種于含10 mL 37℃培養液的培養皿中;37℃、5%CO2條件下，靜止培養2～3周;當培養皿中出現肉眼可見的克隆時終止培養，固定染色后，流水洗去染色液，干燥后計數。

1.2.3 細胞凋亡及細胞周期檢測 采用流式細胞術。收集細胞，以冷PBS沖洗2次后，取5×105/mL用500μL Bind Buffer重懸。加入5μL Annexin-VFITC及10μL PI，輕柔地搖動細胞懸液后，置于室溫下避光保存15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。將轉染后的細胞收集后，用70%冰乙醇固定過夜，PBS洗滌后加入PI(50μg/mL)，4℃避光染色30 min后上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.4 Wee1、c-Myc、CyclinD1、Bcl-2、Bax 基因表達檢測 采用RT-PCR法。用Trizol抽提胃癌細胞總RNA，取RNA逆轉錄體系中合成cDNA，以cDNA為模板加入靶基因上下游引物進行PCR擴增。同時以β-actin作為內參。各引物如下:人Bmal1(153 bp):F:5'-GTAACCTCAGCTGCCTCGTC-3'，R:5'-TAGCTGTTGCCCTCTGGTCT-3';人Wee1(152 bp):F:5'-TGAAGAGGGCGATAGTCGTT-3'，R:5'-TTTCATGCCATTGATCTCCA-3';人c-Myc(207 bp):F:5'-GTCAAGAGGCGAACACACAA-3'，R:5'-TTTCCGCAACAAGTCCTCTT-3';人CyclinD1(204 bp):F:5'-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3'，R:5'-CCACTTGAGCTTGTTCACCA-3';人Bcl-2(176 bp):F:5'-GGAGGATTGTGGCCTTCTTT-3'，R:5'-GCCGTACAGTTCCACAAAGG-3';人Bax(188 bp):F:5'-TCTGACGGCAACTTCAACTG-3'，R:5'-TTGAGGAGTCTCACCCAACC-3';人 βactin(241 bp):F:5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'，R:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'。

1.2.5 Wee1、c-Myc、CyclinD1、Bcl-2、Bax 蛋白表達檢測 采用Western blot法。細胞低溫充分勻漿后，加入蛋白裂解液及PMSF，冰上放置40 min，4℃12 000 r/min離心40 min，取上清。以BSA為標準，用Bradford法對上清進行蛋白定量。取20μg蛋白樣品，10%SDS-PAGE電泳，轉移至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37℃封閉1 h，一抗4℃過夜。同時取另一張不含抗體TBS-T液孵育作為陰性對照。反復洗膜后將膜與堿性磷酸酶AP標記的二抗抗體孵育，室溫輕搖1 h，洗膜后用Western blot印跡觀察，用圖像分析測定各帶吸光度值作定量分析。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，比較采用t檢驗;計數資料比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 載體構建與細胞轉染 重組pGCsilencerTMBmal1(+)載體經測序鑒定，與目的序列完全符合，提示載體構建成功。見圖 1A。通過 Lipofectamine2000轉染 pGCsilencerTM-Bmal1(+)至BGC-823細胞，通過流式細胞術測定轉染率為93.57%，且可見節律基因Bmal1穩定抑制。見圖1B、1C。

2.2 Bmal1沉默對細胞生長的影響 兩組均觀察250個細胞，空白組平均克隆數為52.70個，克隆形成率為21.08%;轉染組平均克隆數為46.70個，克隆形成率為18.68%。兩組克隆形成率比較 P＞0.05。

2.3 節律基因Bmal1對細胞凋亡及相關基因Bax、Bcl-2和c-Myc的影響 如圖2所示，轉染組早期及晚期凋亡率分別為7.92%和5.56%，空白組分別為7.26%和5.25%;轉染組總凋亡率為13.57%，顯著高于空白組(12.51%，P＜0.05)。圖3可見，轉染組節律基因Bmal1的沉默導致Bcl-2、Bax mRNA表達下調(2-△△t=0.120 3，P ＜0.01;2-△△t=0.925 2，P＞0.05)，c-Myc mRNA 表達上調(2-△△t=1.102 2，P＜0.05)?？沟蛲龌駼cl-2和Bcl-2/Bax比值均有顯著下調(P＜0.05)。蛋白水平結果與mRNA類似。如圖4所示。

圖1 shRNA穩定沉默Bmal1在胃癌細胞BGC-823中的表達

圖2 流式細胞術檢測細胞凋亡率

2.4 節律基因 Bmal1對細胞周期及相關基因CyclinD1、Wee1和 c-Myc的影響 與空白組(17.0%、56.0%、26.61%)比較，轉染組節律基因Bmal1沉默可導致G2期延長(31.8%)、G1期縮短(41.58%)(P 均 ＜0.01)，S 期無顯著變化(P ＞0.05)。轉染組節律基因Bmal1的沉默導致c-Myc的 mRNA 水平的增加(2-△△t=1.102 2，P ＜0.05)，而CyclinD1及Wee1的增高未見統計學意義(2-△△t=2.169 0，P ＞0.05;2-△△t=1.112 0，P ＞0.05)。見圖3。蛋白水平結果與mRNA類似。如圖4所示。

3 討論

圖3 各組中相關基因mRNA的表達

Bron等［4］研究發現，節律基因對胃腸道動力、代謝、消化及黏膜增生等的調節具有重要作用。Konturek等［5］研究證實，腸道Paneth細胞和腸道神經系統有自身節律基因表達。我們既往的研究也提示，胃癌細胞BGC-823和MKN28中有Bmal1、Clock和Per1的表達，可見節律基因Bmal1表達差異可能給胃癌的發生、發展及治療提供了一個新的切入點。為此，本研究探討了Bmal1對胃癌細胞生長的影響及機制。

圖4 各組中相關因子蛋白水平的表達

為了特異性研究節律基因Bmal1對細胞生長的影響，本研究采用了pGCsilencerTM-Bmal1(+)質粒穩定沉默Bmal1的表達。細胞克隆形成實驗結果顯示，節律基因Bmal1能抑制細胞克隆形成，盡管兩組沒有顯著差異，但流式細胞術檢測到節律基因Bmal1沉默導致更高的細胞凋亡;可見降低節律基因Bmal1表達可阻止細胞增殖并誘導細胞凋亡，其途徑可能是多方面的。本研究既從細胞增殖、凋亡角度揭示了節律基因Bmal1參與胃癌的生長調控。

既往研究表明，腫瘤的生長和細胞過度增生及凋亡減少相關，為進一步了解釋Bmal1介導的調節胃癌增殖/凋亡機制，本實驗選用 Bcl-2、Bax和 c-Myc作為內源性細胞凋亡相關因子進行研究。既往實驗表明，Bax是促凋亡因子、Bcl-2抗凋亡，同時c-Myc在凋亡中的調控作用在腫瘤發展中也具有顯著作用，可導致細胞DNA損傷，最終引起組織增生和腫瘤的產生。本研究結果顯示，轉染組Bcl-2、Bax表達降低，c-Myc表達增高，和此前Bmal1介導的細胞生長受到抑制，促進了細胞凋亡的結果一致，可見Bmal1可能通過抑制Bcl-2、c-Myc脫抑制來抑制胃癌細胞生長。這與Cao等［6～8］研究結果并不完全一致，可能與節律基因不同和研究細胞不同有關。

生物節律和細胞周期是一個以互鎖的以自動調控環為基礎的體系［9］。節律基因控制許多細胞周期相關的基因表達，生物節律的震蕩并不依賴于細胞周期。本實驗檢測到Bmal1沉默導致了細胞周期的顯著變化，即G2期的增長及G1期縮短，S期未見顯著變化。由于細胞周期主要由G1期決定，Bmal1下調加速G1期向S期轉變，即細胞周期可由Bmal1控制;G2期延長說明細胞損傷嚴重，即Bmal1通過細胞周期影響細胞生長［10］。同時已證實，Wee1、c-Myc及 CyclinD1是 G2/M、G0/G1、G1/S轉換的細胞周期關鍵因子［11～13］，Bmal1 輕度增加 Wee1 和CyclinD1表達的同時顯著增加了c-Myc的表達。因此認為，Bmal1在不同層次控制細胞增殖，包括細胞周期的調節。然而，轉染組Bmal1沉默細胞后，S期無顯著變化，提示可能有其他細胞周期調節因子參與細胞周期的調控。

總之，Bmal1可以抑制胃癌細胞增殖，促進細胞凋亡，有可能成為誘導胃癌細胞凋亡的新靶點。但其功能及調節機制還有待進一步研究。

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