泰山白首烏的急性毒性和遺傳毒性分析

盧連華，姚文環，謝 瑋，顏 燕，郭 婕，田易玲，徐凌川

(1山東省疾病預防控制中心，濟南250014;2山東中醫藥大學藥學院)

泰山白首烏為蘿藦科、鵝絨藤屬、戟葉牛皮消的塊根，是傳統的滋補中藥之一［1］。目前，對泰山白首烏的文獻報道多集中在人工種植研究和化學成分研究［2～5］，鮮見其安全性評價方面的報道。2011年1月～2012年10月，我們觀察了泰山白首烏的急性毒性及遺傳毒性，為其進一步開發和利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 泰山白首烏經粉碎后過100目篩作為受試物供試驗用，由山東中醫藥大學藥學院提供。7周齡、SPF級、Wistar大鼠20只，雌雄各半，體質量180～220 g，由山東大學實驗動物中心提供，生產許可證號:SCXK(魯)2009-0001;7周齡、SPF級、ICR小鼠75只，雌鼠25只、雄鼠50只，體質量25～32 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物合格證號:SCXK(京)2009-0004;飼養環境為屏障級，合格證號:SYXK(魯)2008-0005。試驗期間，動物房環境溫度為22～24℃，相對濕度為50% ～60%。試驗動物可自由攝食、飲水。試驗菌株和肝微粒體酶(S-9)體外代謝活化系統:鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型 TA97、TA98、TA100、TA102 菌株，由中國疾病預防控制中心營養與食品安全所提供;體外活化系統為多氯聯苯誘導的大鼠肝勻漿制備的S-9混合液，由本實驗室自制。敵克松，Riedel-Haen公司，批號:45482;2-氨基芴，美國Fluka Chemie AG公司，批號:252361689;1，8-二羥蒽醌，美國 Merck-Schuchardt公司，批號:7238243;二甲基亞砜，上海試劑總廠，批號:20040101。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗 按照最大耐受量(MTD)法進行試驗。試驗前大鼠空腹16 h，不限制飲水。采用滿足灌胃要求的最大配制濃度(0.40 g/mL)，即稱取40 g受試物，以蒸餾水配至100 mL，終濃度為0.40 g/mL。每隔4 h灌胃1次，共灌胃2次，每次灌胃量為2 mL/100 g，累計染毒劑量為16.0 g/kg，連續觀察14 d，記錄動物的中毒表現及死亡情況。

1.2.2 遺傳毒性試驗

1.2.2.1 Ames試驗 采用鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型 TA97、TA98、TA100、TA102 四種菌株進行試驗。試驗設立 8、40、200、1 000、5 000 μg/皿 5 個劑量，同時設立自發回變組(未處理對照組)、溶劑對照組和陽性對照組。稱取受試物5.00 g，置于容量瓶中，以蒸餾水作溶劑，定容至100 mL，濃度為50 000μg/mL，用蒸汽消毒器0.068 Mpa 20 min處理，冷卻后取出放置4℃保存。取無菌蒸餾水依次進行 1∶4 稀釋，得出濃度分別為10 000、2 000、400、80μg/mL。每皿加入0.1 mL，受試物濃度分別相當于5 000、1 000、200、40、8 μg/皿。試驗采用多氯聯苯誘導的大鼠S-9作為體外代謝活化系統。在頂層瓊脂中加入0.1 mL試驗菌株增菌液、0.1 mL受試物和0.5 mL S-9混合液(當需要代謝活化時)，混勻后倒入底層培養基平板上。37℃培養48 h，計數每皿菌落數。試驗在加S-9與不加S-9混合液的條件下進行，每個組別設3個平皿。若受試物的回變菌落數為自發回變組菌落數的2倍以上，并具有劑量—反應關系則判定為陽性。整套試驗在相同條件下重復做2次。

1.2.2.2 骨髓細胞微核試驗 采用間隔24 h 2次經口灌胃法。選擇體質量25～30 g小鼠50只，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半。設立3個試驗組，高劑量采用最大配制濃度(0.40 g/mL)，灌胃量為0.2 mL/10 g，則染毒劑量為8.0 g/kg，中、低劑量組染毒劑量分別設計為5.0、2.5 g/kg，另設蒸餾水陰性對照組和環磷酰胺陽性對照組(40 mg/kg)。各組均以0.2 mL/10 g灌胃，共2次，間隔24 h，末次給予受試物6 h后頸椎脫臼處死動物，取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，甲醇固定，Giemsa染色。光學顯微鏡下，每只動物計數1 000個嗜多染紅細胞(PCE)，計算微核率(即微核細胞數/嗜多染紅細胞數，以千分率表示)。同時觀察200個PCE，計數觀察到的正染紅細胞(NCE)數目，并計算PCE/NCE比值。

1.2.2.3 精子畸變試驗 選擇體質量29～32 g雄性小鼠25只，隨機分為5組，每組5只。設立3個試驗組，高劑量采用最大配制濃度(0.40 g/mL)，灌胃量為0.2 mL/10 g，則染毒劑量為 8.0 g/kg，中、低劑量組染毒劑量分別設計為5.0、2.5 g/kg，另設蒸餾水陰性對照組和環磷酰胺陽性對照組(40 mg/kg)。各組實驗動物均以0.2 mL/10 g灌胃，每天灌胃1次，連續5 d，首次灌胃后第35天處死動物，取兩側副睪制片，甲醇固定，2%伊紅染色。每只動物計數1 000個結構完整的精子，記錄畸變類型和數量，計算精子畸形率(以百分率表示)。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，比較采用Dunnett t檢驗;計數資料以百(千)分率表示，比較采用 χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 急性經口毒性試驗 以16.0 g/kg劑量的泰山白首烏藥液對Wistar大鼠進行灌胃后，所有大鼠未見明顯中毒癥狀，觀察14 d無死亡，觀察期間大鼠體質量增加正常。觀察期末處死動物進行大體解剖，肺、肝、胃、腸、腎臟等主要臟器未見肉眼可見的異常改變。

2.2 遺傳毒性試驗

2.2.1 Ames試驗 無論加或不加S-9，各受試物劑量組的平均回變菌落數均未超過陰性對照兩倍，即泰山白首烏對四種菌株無誘變作用，亦無劑量—反應關系。見表1、2。

3.2.2 骨髓嗜多染紅細胞微核試驗 見表3。

3.2.3 精子畸形試驗 見表4。

3 討論

泰山白首烏就是指白首烏來源之一的蘿藦科植物戟葉牛皮消。作為泰山四大名藥之首，目前仍廣泛應用，具有養血益肝、固精益腎、強筋健骨、烏須黑發等療效。其性不寒不燥，主治身體虛弱、健忘多夢、失眠、皮膚瘙癢等多種疾病。對泰山白首烏的研究，國內外僅見到化學成分研究的報道，鮮見到泰山白首烏毒理藥理作用的研究。Li等［6］從泰山白首烏中發現 Bungeiside A、B、C、D，4-羥基苯乙酮、2，4—二羥基苯乙酮等成分。Liu等［7］從泰山白首烏中分離得到4個苯乙酮類化合物，分別為白首烏二苯酮、4-羥基苯乙酮、2，4-二羥基苯乙酮、2，5-二羥基苯乙酮。Gan等［8］從泰山白首烏中分離得到6個新的C21甾體類化合物。

本研究結果顯示，泰山白首烏對大鼠的LD50大于16.0 g/kg，根據急性毒性分級標準，泰山白首烏屬無毒級。遺傳毒性試驗表明，在Ames試驗中，無論加或不加S-9，陽性對照組的平均回變菌落數均為陰性對照組的兩倍以上，說明此Ames試驗系統對致突變物敏感。溶劑對照的平均回變菌落數與自發回變組的回變菌落數相近，說明所用的溶劑無致突變作用。各劑量組的平均回變菌落數均未超過陰性對照組的兩倍，亦無劑量—反應關系，說明在加與不加S-9時泰山白首烏對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102四種菌株無誘變作用。在微核試驗中，各劑量組小鼠的微核率和PCE/NCE比值均在正常范圍內，表明泰山白首烏無致小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核作用。在精子畸形試驗中，各劑量組小鼠的精子畸形率和精子畸變類型構成比也無異常，說明泰山白首烏無致小鼠精子畸形作用。因此，泰山白首烏無遺傳毒性。

表1 不同劑量泰山白首烏對鼠傷寒沙門氏菌回復突變數的影響(第1次)(n=3，ˉx±s)

表2 不同劑量泰山白首烏對鼠傷寒沙門氏菌回復突變數的影響(第2次)(n=3，ˉx±s)

表4 不同劑量泰山白首烏對小鼠精子畸形試驗結果

［1］徐凌川，馬鳳英，郭素，等.泰山白首烏藥材質量標準初步研究［J］.食品與藥品，2006，8(1):41-43.

［2］徐凌川，張華，王建平，等.泰山白首烏揮發油成分分析［J］.中藥材，2004，27(2):97-98.

［3］徐凌川.人工栽培泰山白首烏藥材總多糖含量測定［J］.山東中醫雜志，2008，27(3):193-195.

［4］徐凌川，張榮君，張華，等.泰山白首烏規范化種植基地環境質量評價［J］.山東中醫雜志，2007，26(10):709-710.

［5］張榮君，徐凌川，郭素，等.泰山白首烏規范化種植研究［J］.現代中藥研究與實踐，2007，21(6):3-6.

［6］Li J，Kadota S，Kawata Y，et al.Constituents of the roots of Cynanchum bungei Decne.Isolation and structures of four new glucosides，bungeiside-A，-B，-C，-D［J］.Chem Pharm Bull(Tokyo)，1992，40(12):3133-3137.

［7］Liu ZB，Sun YS，Wang JH，et al.Preparative isolation and purification of acetophenones from the Chinese medicinal plant Cynanchum bungei Decne by high-speed counter-current chromatography［J］.Sep Purif Technol，2008，64:247-252.

［8］Gan H，Xiang WJ，Ma L，et al.Six new C-21 steroidal glycosides from Cynanchum bungei Decne［J］.Helv Chim Acta，2008，91:2222-2234.