四種海螺中左卡尼汀及其酰化物含量比較

曹 玉，王晨靜，趙 霞，李存友，王宏廣，王春波，管華詩

(1中國海洋大學醫(yī)藥學院，山東青島266100;2青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院;3青島大學醫(yī)學院)

左卡尼汀(LC)，又叫左旋肉堿、肉毒堿、維生素BT，與其酰化產物乙酰左卡尼汀(ALC)和丙酰左卡尼汀(PLC)等共同構成人體內的卡尼汀群，是動物體內脂肪代謝不可缺少的營養(yǎng)素，在食品加工、動物養(yǎng)殖、醫(yī)療保健等領域應用廣泛［1］。目前，關于LC的研究多集中在牛、羊等肉類食品，在海洋產品中研究較少，而同時觀察海洋產品中LC及其代謝產物的研究鮮見報道。斑玉螺、疣荔枝螺、海螺、鈍擬蟹守螺均為海洋中藥食兩用的海洋產品，是沿海地區(qū)居民餐桌上的常見食品。2012年5～12月，我們采用熒光衍生化高效液相色譜法(HPLC)對4種海螺中LC、ALC、PLC的含量進行了檢測，以期為我國海洋螺類藥用資源的開發(fā)以及沿海地區(qū)居民通過海洋食品攝入LC提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗儀器:Waters2695高效液相色譜儀、Waters474熒光檢測器(美國 Waters公司)，HL130HS血液透析儀 (埃及 Haidylena公司)，METTLER AE240電子天平(博特勒—托利多儀器上海公司)，Milli-Q Biocel純水發(fā)生器［密理博(上海)貿易有限公司］，離心機(德國雅培公司)，MS1 Minishaker渦旋振蕩器(Minishaker公司)。藥品及試劑:LC、ALC、PLC、1-氨基蒽(1-AA)均購自 Sigma 公司，1-乙基-(二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)購自 Fluka公司，乙腈(色譜純)購自美國Honeywell International Inc，丙酮、乙醚、氯仿、乙酸銨等均為國產分析純。斑玉螺、疣荔枝螺、海螺、鈍擬蟹守螺均為鮮活海螺，購自青島臺東水產批發(fā)市場。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取及制備 ①樣品及空白樣品提取:分別取4種新鮮海螺肉50 g，加入3倍量的3%高氯酸溶液，勻漿機中勻漿3 min(3 000 r/min)，3 000 r/min離心10 min，取上清液，用 NaOH調整 pH為7.8。取5 mL，－20℃冷凍保存待測。其余樣品置入血液透析器中，4℃下用1.5%腹膜透析液1.5 mL/min透析24 h后分裝凍存，用于配置標準品。②衍生化試劑:取1-AA 160 mg，丙酮溶解至10 mL，即得EDC溶液。取EDC 1 600 mg，用0.01 mmol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 3.5)溶解至10 mL。

1.2.2 標準曲線配置 分別取LC(9.88 mg)、ALC(4.79 mg)、PLC(6.39 mg)，用水溶解至 10 mL，精密量取適量，加入空白樣品溶液，配置混合標準液，其中 LC 濃度分別為 5、10、20、50、100、200、400、800 μmol/L，ALC 濃度分別為0.4、1、2、4、10、20、50、100 μmol/L，PLC 濃度分別為 0.2、0.5、1、2、5、10、25、50 μmol/L。

1.2.3 高效液相色譜條件 色譜柱:Hypersil C18柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm);流動相:0.1 mol/L 乙酸銨—乙腈(67∶33);流速為1.0 mL/min;波長:Ex 248 nm，Em 418 nm;進樣量:50 μL。

1.2.4 LC、ALC、PLC 含量檢測 取各樣本的標準樣和待測樣提取液100μL，加入500μL乙腈沉淀蛋白，10 900 r/min離心5 min，取上清液500μL，加入400μL磷酸緩沖液(pH 3.5)，20μL稀鹽酸(1 mol/L)，混勻后加入1-AA溶液100μL，緩慢加入100μL EDC，室溫避光衍生化30 min。然后用乙醚(3 mL)萃取2次，棄掉乙醚相，在水相中加入800 μL磷酸緩沖液(pH 9.1)，渦旋后用氯仿(3 mL)萃取2次，取水相400μL，加同等量的磷酸緩沖液(pH 3.5)，混勻后取50μL進樣分析。取每種海螺的各濃度標準溶液6份，處理后進樣分析，以峰面積的均值為縱坐標，以標準溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，通過精密度、回收率、穩(wěn)定性實驗進行方法學考察，每種海螺分別取6份待測樣品，分別計算濃度，取平均值，得到待測樣品的濃度，計算每100 g樣品中含有LC、ALC、PLC的量。

2 結果

2.1 選擇性實驗結果 取空白樣品、標準溶液、提取樣本處理后進樣分析，得空白樣品色譜圖、標準溶液色譜圖和待測樣本色譜圖(為鈍擬蟹守螺的色譜圖，其余三種產品色譜圖相似，略)。見圖1。結果顯示，在測定時間范圍內，空白樣品無測定成分的干擾;標準溶液中 LC、ALC、PLC 分別在 7.233、10.328、14.137 min 出峰，峰形良好，分離完全，無干擾;待測樣本中分別在對應的保留時間內檢測出相應的成分。

圖1 鈍擬蟹守螺的LC、ALC和PLC高效液相色譜圖

2.2 標準曲線 熒光衍生化HPLC精密度＜4%、回收率96% ～103%、穩(wěn)定性＜3.8%，證明該方法穩(wěn)定、準確、靈敏，能達到檢測的目的。其標準曲線方程以及檢測限、相關系數見表1。

2.3 各樣品LC、ALC、PLC含量 見表2。

3 討論

LC是由俄國科學家Guliewitsch和Krimberg于1905年在肌肉提取物中發(fā)現的［2］，并鑒定其結構式為L-β-羥基-γ-三甲氨丁酸。它的基本功能是與長鏈脂肪酸結合，帶動長鏈脂肪酸向線粒體內膜的轉運，使脂肪酸在線粒體酶的作用下發(fā)生β-氧化，再將脂肪酸β-氧化的產物轉運出線粒體，最終有利于脂肪的進一步分解［3，4］。人體內的卡尼汀群來源主要有內源性和外源性兩種，內源性的LC主要在肝、腎和大腦中合成［5］;外源性的主要來自藥物和肉類食品［6］，正常人體內的LC 25%自身合成、75%來自食物，在動物的骨骼肌中含量最高。1993年美國FDA專家委員會確認LC安全、無毒，美國藥典第23版開始收載LC原料和制劑。LC在醫(yī)療上主要用于治療慢性腎疾病引起的肉堿缺乏、心肌疾病和心率失常、調節(jié)血脂及血壓等，在神經系統(tǒng)疾病、內分泌系統(tǒng)疾病以及減肥和男性不育癥也有效果;作為保健品和食品添加劑可用于減肥、運動保健、抗衰老、嬰兒奶粉以及其他食品中;作為飼料添加劑添加在水產養(yǎng)殖飼料中，可以提高生長速度，降低飼料系數，改善魚肉品質，提高魚類繁殖率［7］，市場潛力巨大。ALC經ALC轉移酶在人體的腦、肝臟處被合成，能夠促進線粒體在脂肪酸氧化過程中對乙酰輔酶A的攝取，增加乙酰膽堿的生成，并刺激蛋白質和膜磷脂的合成。能夠迅速通過血腦屏障，改善神經能量，修復神經作用機制并調節(jié)中樞神經系統(tǒng)中乙酰膽堿的生成，能夠有效治療和預防老年性癡呆。PLC為肉毒堿乙酰轉移酶刺激劑，可劑量依賴性擴張微血管，選擇性的保護內皮細胞不受組織缺氧或過氧化酶制劑引起的損傷。目前，臨床上主要用于充血性心力衰竭、外周血管疾病、間歇性跛行等疾病。隨著卡尼汀群的研究越來越受到重視，其臨床應用亦越來越廣泛。

表1 四種海螺樣品的LC、ALC、PLC標準曲線方程

表2 四種海螺樣品的LC、ALC、PLC含量(μmol/100 g)

本研究在前期［8，9］對血漿、尿液等樣品含量測定的基礎上，建立了從海螺肉中提取LC、ALC、PLC，并用熒光衍生化HPLC檢測其含量，樣本衍生化后色譜峰分離良好，干擾少，檢測時間短，且靈敏度高、檢測限低，且室溫條件下即可衍生化反應，操作簡便。經精密度、穩(wěn)定性和回收率實驗證明均能達到檢測的要求，適用于食品、藥品、組織以及治療性檢測需要。在方法學實驗條件的探索過程中，考慮到四種海螺制備標準曲線時均需要制備空白溶液以排除內源性LC的干擾，本實驗在前期研究的基礎上采用透析器透析方法制備各樣品卡尼汀群的空白溶液［8］。空白樣品的色譜圖顯示，采用透析法可以有效去除內源性LC的干擾及其樣本中其他未知物質的干擾，符合本實驗檢測海洋產品的質量要求。檢測結果顯示，鈍擬蟹守螺中 LC、ALC、PLC含量最高，其次為疣荔枝螺、斑玉螺，海螺中含量最低。提示沿海居民常食鈍擬蟹守螺可以攝取較多的LC、ALC和PLC，同時也為下一步通過提取制備卡尼汀群原料提供理論依據。

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