不同濃度腫瘤壞死因子-α對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的影響

徐采云，李 理，袁偉鋒，黃文杰

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣州510515;2廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院)

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)常用于復(fù)制炎癥、凋亡相關(guān)的動(dòng)物和細(xì)胞模型。近年研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α能促進(jìn)活性氧(ROS)的產(chǎn)生［1，2］，其產(chǎn)生量的多少反映了氧化應(yīng)激水平的高低。以往我們研究發(fā)現(xiàn)，ROS與TNF-α存在濃度依賴，隨TNF-α濃度增加，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的量隨之增加。Tonks等［3］研究發(fā)現(xiàn)，ROS含量低的氧化應(yīng)激編碼抗氧化酶的Nrf-2活化，細(xì)胞受到保護(hù);ROS含量較高的氧化應(yīng)激通過活化NF-κB和AP-1誘導(dǎo)炎癥反應(yīng);而ROS含量更高的氧化應(yīng)激主要導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。基于此，我們提出了不同濃度TNF-α可能產(chǎn)生保護(hù)、促炎、促細(xì)胞凋亡等不同細(xì)胞效應(yīng)。2012年2～12月，我們觀察了不同濃度TNF-α對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 肺腺癌A549細(xì)胞由廣州軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科保存，人重組TNF-α購(gòu)于以色列Prospec公司，引物由英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR酶購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，DAPI試劑購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司，MTT及ROS檢測(cè)試劑購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用RPMI 1640培養(yǎng)基加10%小牛血清培養(yǎng)肺腺癌A549細(xì)胞，置37℃ 5%CO2孵箱中孵育。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)融合傳代。選擇傳3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL，接種于6孔板中，培養(yǎng)基中加入終濃度為100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素。

1.2.2 細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用MTT比色法。根據(jù)TNF-α 誘導(dǎo)濃度不同，設(shè) TNF-α 0(對(duì)照組)、1、10、25、50、100 ng/mL組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/mL接種至96孔板，100μL/孔，生長(zhǎng)24 h后更換無(wú)血清培養(yǎng)基，2 h更換相應(yīng)TNF-α終濃度的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。每孔加入 10μL MTT(終濃度為5 mg/L)。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入100μL Formanzan溶解液在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm光吸收值(OD)。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD－空白組OD)/(對(duì)照組OD－空白組OD)。

1.2.3 ROS檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肺腺癌A549細(xì)胞，接種于 24 孔板，分別以 0、1、10、25、50 ng/mL TNF-α處理6 h，PBS洗滌3次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋成1∶1 000 DCFH-DA探針繼續(xù)孵育1 h，PBS洗滌3次后，螢光酶標(biāo)儀觀察各組ROS強(qiáng)度。

1.2.4 Nrf-2、NF-κB mRNA 表 達(dá) 檢 測(cè) 采 用RT-PCR法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肺腺癌A549細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，分別以 0(對(duì)照組)、1、10、25、50 ng/mL TNF-α處理6 h。裂解細(xì)胞提取RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。人 NF-κB［4］:上游引物:5'-GGGAAGGAACGCTGTCA-3'，下游引物:5'-TAGCCTCAGGGTACTCCAT-3'，片段長(zhǎng)204 bp;人 Nrf-2:上游引物:5'-ATTGCCTGTAAGTCCTGGTCA-3'，下游引物:5'-ACTGCTTTGGACACATTTCG-3'，片段長(zhǎng) 180 bp;人β-actin:上游引物:5'-AGGGAAATCGTTGCGTGACATCA-3'，下游引物:5'-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3'，片段長(zhǎng) 476 bp。按照 95 ℃ 30 s、52 ℃30 s、72℃ 30 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，行凝膠電泳，用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Gel-Pro Analyzer 32進(jìn)行灰度值測(cè)定。

1.2.5 細(xì)胞凋亡觀察 在24孔板中放置滅菌玻片，取細(xì)胞密度1×105/mL的肺腺癌 A549細(xì)胞1 mL接種至孔板中，分別設(shè) TNF-α0(對(duì)照組)、1、10、25、50 ng/mL組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后更換無(wú)血清培養(yǎng)基，2 h后更換相應(yīng)TNF-α終濃度的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。按照DAPI細(xì)胞核熒光染色法處理細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以ˉx±s表示，多重比較用One-Way-ANOVA檢驗(yàn)，方差齊用LSD檢驗(yàn)，方差不齊用Tamhane檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TNF-α對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞存活率的影響 TNF-α 1、10、25、50 ng/mL組細(xì)胞存活率分別為(113.3 ±2.0)%、(94.7 ±1.8)%、(93.8 ±0.3)%及(90.0±2.0)%，與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。TNF-α100 ng/mL組細(xì)胞存活率為(78.0±1.3)%，與對(duì)照比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說明TNF-α0～50 ng/mL對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞無(wú)毒性作用，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)不再設(shè)100 ng/mL組。

2.2 不同濃度 TNF-α對(duì)肺腺癌 A549細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響 DCFH-DA染色后，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組ROS平均熒光強(qiáng)度(MFI)為177.0±10.6;TNF-α 誘導(dǎo)后，ROS MFI較對(duì)照組均有升高，其中1 ng/mL 組 MFI為 183.3 ±7.6、10 ng/mL組為361.3 ±36.0、25 ng/mL 組為 525.0 ±25.0、50 ng/mL組為693.0±19.3。表明肺腺癌 A549細(xì)胞ROS的產(chǎn)生隨 TNF-α濃度增加而升高(P均 ＜0.05)。

2.3 不同濃度 TNF-α 對(duì) Nrf-2、NF-κB mRNA 表達(dá)的影響 Nrf-2的表達(dá)隨TNF-α濃度增加表達(dá)下調(diào)(P 均 ＜0.05)，NF-κB 的表達(dá)隨 TNF-α 濃度的增加而增加(P均＜0.05)。見表1。

表1 不同濃度TNF-α對(duì)Nrf-2、NF-κB mRNA表達(dá)的影響(ˉx ±s)

2.4 不同濃度TNF-α對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的影響 DAPI染色后，熒光顯微鏡觀察顯示，隨著TNF-α刺激濃度的增加，細(xì)胞核染色加深，出現(xiàn)核濃縮(25 ng/mL組)等早期凋亡的特征，甚至出現(xiàn)核碎裂成大小不等的圓形小體(50 ng/mL組)等晚期凋亡的表現(xiàn)。說明TNF-α誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的能力也存在濃度依賴性。見圖1。

圖1 TNF-α對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的影響(n=3)

3 討論

TNF-α是由巨噬細(xì)胞分泌的一種具有復(fù)雜生物活性的細(xì)胞因子，對(duì)多種體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，已經(jīng)作為抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床。臨床已證實(shí)，TNF-α進(jìn)入腫瘤細(xì)胞是沿微管移動(dòng)與溶酶體結(jié)合，使溶酶體破裂，釋放出溶酶體酶導(dǎo)致細(xì)胞自溶，且對(duì)正常組織細(xì)胞無(wú)影響。目前，TNF-α作為一種多功能的細(xì)胞因子，應(yīng)用于急慢性炎癥、腫瘤等疾病中。

關(guān)于TNF-α信號(hào)通路的研究表明，TNF-α能通過活化編碼抗氧化酶基因抑制JNK活化，增強(qiáng)細(xì)胞存活能力［5］;TNF-α 能誘導(dǎo) ROS的產(chǎn)生，使 MKPs失活，從而導(dǎo)致JNK活化及細(xì)胞凋亡［6］。本實(shí)驗(yàn)室用TNF-α復(fù)制急性肺損傷細(xì)胞模型過程中也發(fā)現(xiàn)，TNF-α處理細(xì)胞后，既能活化編碼抗氧化酶的Nrf-2基因，產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用;又能活化炎癥因子NF-κB，甚至促進(jìn)凋亡。

NF-κB是炎癥反應(yīng)中被激活的重要轉(zhuǎn)錄因子，其激活后迅速?gòu)陌|(zhì)轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)和調(diào)控多種蛋白的表達(dá)［7］。本研究中，隨著TNF-α刺激濃度增加，NF-κB mRNA表達(dá)增強(qiáng)，提示 TNF-α濃度增加能導(dǎo)致細(xì)胞炎癥水平增加，這與Kim等［8］研究結(jié)果相同。Nrf-2是編碼抗氧化酶的基因，它的活化能促進(jìn)細(xì)胞抗氧化能力，保護(hù)細(xì)胞免受過度的氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)中，Nrf-2 mRNA表達(dá)隨TNF-α濃度增加而降低，提示細(xì)胞抗氧化損傷的能力下降。

本研究還發(fā)現(xiàn)，TNF-α刺激濃度與細(xì)胞胞內(nèi)ROS生成量呈正相關(guān)，TNF-α濃度越高，ROS的生成量越高。Kim等［9］研究也有相同的結(jié)論。有關(guān)ROS作用的研究提示，細(xì)胞產(chǎn)生的ROS超過其抗氧化能力時(shí)，氧化應(yīng)激狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷和疾病的產(chǎn)生;產(chǎn)生的量不多時(shí)，ROS作為第二信使調(diào)控基因的表達(dá)［10，11］。由此可知，ROS 生成量的不同，產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)也不同，而TNF-α與ROS之間存在濃度依賴關(guān)系。因此，TNF-α處理后的肺腺癌A549細(xì)胞產(chǎn)生了不同的細(xì)胞效應(yīng)，可能與ROS的產(chǎn)生量不同有關(guān)。

綜上所述，不同濃度TNF-α對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞有不同的細(xì)胞效應(yīng)，其機(jī)制可能與不同濃度TNF-α使肺腺癌A549細(xì)胞產(chǎn)生ROS的量不同有關(guān)。

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