Cx43基因shRNA慢病毒載體的構建及其對大鼠心肌細胞Cx43基因的作用

陳 立，鐘國強，涂榮會，黎慶捷，何 艷

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

縫隙連接蛋白(Cx)43是構成哺乳動物心肌縫隙連接通道的主要蛋白，在介導心肌電偶聯實現心房或心室同步收縮、保證心臟正常節律性方面具有重要作用。研究表明，Cx43在缺血再灌注損傷及其保護作用方面具有重要的調控作用［1，2］。本課題組前期研究結果顯示，Cx43通過開放線粒體ATP敏感性鉀通道參與缺血后處理的心肌保護［3］。為進一步探討缺血后處理的心肌保護機制，2011年3～9月，本研究成功構建了Cx43基因RNA干擾慢病毒載體，并感染大鼠心肌細胞，以驗證其對大鼠心肌細胞Cx43基因的作用，為后期研究Cx43基因在心肌缺血后處理的心肌保護提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級SD大鼠12只，雌雄不限，鼠齡1～3 d，體質量6～8 g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供。293T細胞株，中國科學院細胞研究所提供;慢病毒載體系統(pGCL-GFP、pHelper1.0 及pHelper2.0質粒)，上海吉凱基因化學技術有限公司;限制性內切酶、T4DNA連接酶，NEB公司;Lipofectamine2000、Trizol，Invitrogen 公司;質粒抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒，Qiagen公司;熒光定量PCR試劑盒，羅氏公司;兔抗鼠Cx43抗體，Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 Cx43 RNA干擾慢病毒載體構建 從GenBank中查找大鼠 Cx43 mRNA序列號(NM_012567)，根據Ambion公司軟件設計合成4對Cx43基因 shRNA序列。通過 GenBank數據庫進行BLAST分析及預實驗，最終確定干擾靶序列siRNA為5'-GAAGAGAAGCTAAACAA-3'，設計合成含有酶切粘端的正向和互補的兩對shRNA序列，退火后得到的兩條含兩種shRNA的、約60 bp的寡核苷酸雙鏈(見表1)，與Hpa I和Xho I雙酶切pGCL-GFP載體連接、轉化，挑選陽性克隆行PCR鑒定及測序。

表1 病毒載體構建框架

1.2.2 慢病毒包裝及滴度測定 取對數生長期293T細胞，調整細胞密度為 5.0×105/mL。Opti-MEM培養基稀釋 pGCL-GFP、pHelper1.0 以及pHelper2.0載體，脂質體 Lipofectamine2000 介導下感染293T細胞，培養8 h后換完全培養基繼續培養48 h，收集上清液，過濾，4 000 g離心10 min濃縮，分裝后－80℃保存。取其中1支進行濃度滴定，滴定方法如下:取出分裝凍存的293T細胞接種于96孔板中，每孔5.0×104個細胞，體積為100μL。24 h后將96孔板每孔吸去90μL DMEM培養基，加入90 μL 含病毒原液分別為 10、1、10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6μL 的病毒顆粒稀釋液。培養 24 h后，更換為完全培養基，倒置熒光顯微鏡下觀察帶綠色熒光(綠色熒光蛋白，GFP)的細胞數量。每孔GFP細胞數量除以該孔病毒原液量即為病毒滴度。

1.2.3 慢病毒轉染大鼠心肌細胞 大鼠心肌細胞培養參照 Webster等［4］方法，按 1.0 ×106/mL 接種于培養板中，細胞接種72 h后行病毒轉染。設空白對照(C)組、陰性對照(NC)組及基因沉默(KD)組，C組不加任何病毒原液，NC組及KD組按感染復數(MOI)值為100的病毒量分別加入NCsiRNA及KDsiRNA病毒原液。轉染72 h后觀察慢病毒GFP表達情況，熒光率大于80%者，提取細胞RNA以及總蛋白進行檢測。

1.2.4 大鼠心肌細胞Cx43 mRNA表達檢測 采用real-time PCR法。設計 Cx43上游引物:5'-TGAAAGAGAGGTGCCCAGAC-3'，下 游 引 物:5'-GCAGCCAGGTTGTTGAGTG-3';以大鼠GAPDH基因作內參，上游引物:5'-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3'，下游引物:5'-CTCAGCACCAGCATCACC-3'。收集轉染后大鼠心肌細胞，Tirzol試劑法提取細胞總RNA，測定總RNA濃度及OD值，按Fermentas試劑盒操作將RNA逆轉錄為cDNA。擴增條件:95℃預變性15 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共45個循環，在擴增反應結束后進行溶解曲線分析。

1.2.5 大鼠心肌細胞Cx43蛋白表達檢測 采用Western blot法。抽提轉染后細胞總蛋白，行SDSPAGE電泳，將蛋白電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉TBST溶液封閉1 h，兔抗鼠Cx43單克隆抗體4℃孵育過夜，洗膜，鼠抗兔IgG二抗孵育1 h，按ECL試劑盒顯色，暗室內行膠片曝光顯影。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，結果比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Cx43基因shRNA慢病毒載體的鑒定及其滴度 Cx43基因shRNA的Oligo DNA經退火形成三對雙鏈 DNA，經 Hpa I和 Xho I酶切、pFU-GW-siRNA載體連接、轉化后，行陽性克隆PCR鑒定，挑選陽性克隆送測序，鑒定結果與預期一致，表明合成的Cx43 shRNAOligo DNA序列插入正確。根據各孔中的熒光表達量，計算出其滴度為8×108TU/mL。

2.2 慢病毒轉染大鼠心肌細胞的效率 按MOI為100的病毒量轉染大鼠心肌細胞72 h后，82.59%的心肌細胞發出綠色熒光。提示病毒轉染效率較高，且病毒轉染后細胞狀態可。見圖1。

圖1 慢病毒載體轉染大鼠心肌細胞72 h后熒光顯微鏡觀察結果(×100)

2.3 各組Cx43 mRNA及蛋白表達量比較 見表1。與NC組比較，KD組Cx43 mRNA的抑制率為96.10%。使用 Gel Proanalyzer4.0分析軟件檢測Cx43蛋白條帶灰度，以 β-actin為參照，設 NC組Cx43蛋白表達率為100%，計算出KD組Cx43蛋白抑制率為77.16%。

表1 各組Cx43 mRNA及蛋白表達量比較(ˉx±s)

3 討論

RNA干擾現象最初由Fire等［5］在研究線蟲時發現，是利用序列特異性的、與靶基因同源的雙鏈RNA特異性地結合靶mRNA并使其降解，從而抑制靶基因表達的一種轉錄后基因沉默現象［6］。最初的RNA干擾實驗采用體外合成siRNA，但費用較高，轉移到細胞內的siRNA半衰期短，不能持久性表達，對靶基因表達的抑制作用短暫等，從而使其應用受到較大的限制。shRNA載體導入細胞后，能在細胞內穩定地轉錄生成shRNA，并進一步加工生成靶基因特異性siRNA，可發揮長期抑制靶基因表達作用，但普通shRNA無法將其轉染到非分裂期細胞、原代細胞、未分化細胞等。

利用病毒載體(如逆轉錄病毒、腺病毒和慢病毒等)轉染，其轉染效率高、操作簡便及shRNA在宿主細胞中能高效穩定表達，已被廣泛用于RNA干擾的研究和治療;特別是攜帶shRNA載體的慢病毒，有著廣泛的宿主范圍，能感染分裂期與非分裂期細胞［7］，為原代細胞乃至動物個體基因功能的研究提供了可能性，同時也使人和動物的基因沉默治療成為可能［8，9］。其產生的 shRNA 靶向性好，能將外源基因有效地整合到宿主染色體上，持久性表達shRNA，有效抑制了靶基因表達;產生的慢病毒可進一步濃縮，從而大大提高其轉染效率［10］;此外，慢病毒本身對宿主幾乎不產生免疫原性，因而具有更高的安全性。基于上述特點，本實驗選擇慢病毒作為載體，為今后建立離體及在體層面的靶基因抑制動物模型提供基礎。

本研究成功構建Cx43特異性RNA干擾慢病毒載體，其病毒滴度達8×108TU/mL，并成功轉染大鼠心肌細胞，使Cx43 mRNA表達量降低及蛋白表達量升高，為后續研究Cx43在缺血后處理中的心肌保護機制提供了實驗基礎，同時也為與心肌細胞Cx43相關的基礎及臨床研究提供了一個可行的研究手段。

［1］Miura T，Miki T，Yano T.Role of the gap junction in ischemic preconditioning in the heart［J］.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2010，298(4):1115-1125.

［2］Natioh K，Yano T，Miura T，et al.Roles of Cx43-associated protein kinases in suppression of gap junction-mediated chemical coupling by ischemic preconditioning［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296(2):396-403.

［3］何燕，曾志羽，鐘國強，等.線粒體連接蛋白43參與缺血后處理對兔急性心肌缺血再灌注損傷的保護作用［J］.中華心血管病雜志，2010，38(4):357-362.

［4］Webster KA，Discher DJ，Bishopcic NH.Induction and muclear accumulation of fos and jun proto-oncogenes in hypoxic cardiac myocytes［J］.J Bio Chem，1993，268(22):16852-16858.

［5］Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391(6669):806-811.

［6］Hannon GJ.RNA interference［J］.Nature，2002，418(6894):244-251.

［7］Naldini L，Blomer U，Gallay P，et al.In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector［J］.Science，1996，272(5259):263-267.

［8］Schaniel C，Lee DF，Lemischka IR.Exploration of self-renewal and pluripotency in ES cells using RNAi［J］.MethodsEnzymol，2010，477:351-365.

［9］Shimizu S，Hong P，Arumugam B，et al.A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model［J］.Blood，2010，115(8):1534-1544.

［10］Segura MM，Garnier A，Durocher Y，et al.New protocol for lentiviral vector mass production［J］.MethodsMol Biol，2010，614:39-52.