系統性紅斑狼瘡患者外周血中OX40、OX40L mRNA的表達及意義

李桂珍，趙俊芳，陳雪雯，王 蓉，王玉亮

(1天津市中醫藥研究院附屬醫院，天津300120;2天津市第一中心醫院)

系統性紅斑狼瘡(SLE)是多種因素相互作用引起的自身免疫性疾病，其發病機制復雜，與免疫調節異常有關［1］。OX40/OX40L是機體免疫應答過程中一對重要的協同刺激分子，參與了T細胞的活化、增殖、遷移以及生發中心的形成和樹突狀細胞的分化成熟，在機體的免疫應答和多種疾病中具有重要作用。Farres等［2］研究發現，OX40/OX40L與 SLE的發病密切相關。2012年6～11月，我們檢測了30例SLE患者及15例健康體檢者外周血 OX40、OX40L mRNA的表達，并對OX40/OX40L與SLE疾病活動程度的關系進行評估。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇天津市第一中心醫院收治的SLE患者30例(SLE組)，均為女性，年齡(36±7)歲，均符合1997年美國風濕病協會修訂的SLE分類標準。所有入選患者不伴有其他風濕性、代謝性和內分泌疾病。根據SLE疾病活動指數(SLEDAI)評估疾病活動程度，SLEDAI≥10分為活動期，共15例，均為初診未治的初發活動期SLE患者或復發尚未再次治療的活動期SLE患者;SLEDAI＜10分為非活動期，共15例。同期選擇該院健康體檢女性15例作為對照組，年齡(33±7)歲。本研究經過本院倫理委員會批準，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 異硫氰酸熒光素—小鼠抗人CD38單克隆抗體、藻紅蛋白—小鼠抗人CD3單克隆抗體(Biocytex公司，法國)，ABI 7300 PCR擴增儀(Applied Biosystems公司，美國)。FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson公司，美國)。

1.2.2 外周血OX40、OX40L mRNA表達檢測 采用熒光定量RT-PCR法。所有研究對象于清晨空腹采集外周靜脈血，乙二胺四乙酸抗凝。應用TRIzol試劑(GIBCO-BRL公司，美國)提取外周血單個核細胞總 RNA，按逆轉錄酶說明書操作合成 cDNA。OX40上游引物:5'-ACGACGTGGTCAGCTCCAA-3'，下游引物:5'-TCCGCTCACTCCCACTTCTG-3'，探針序列:5'-AAGCCCTGCACGTGGTGTAACC-3';OX40L上游引物:5'-CAGCCAGGCCAAGATTCG-3'，下游引物:5'-CAGCCCCAGTCCCTGAATT-3'，探針序列:5'-AGGAACAAGCTATTGCTGGTGGCCTCTG-3'。OX40、OX40L引物及探針序列為美國Applied Biosystems公司產品。預實驗PCR擴增陽性產物經過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切下目的條帶。用回收試劑盒回收純化后，用OD260測定值和片段長度數據換算出濃度(拷貝/μL)，再做梯度稀釋，制備成定量PCR陽性定量標準品，熒光定量陰性物采用滅菌雙蒸水。PCR反應條件:50℃ 2 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 20 s，55 ℃30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS12.0統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，兩組間比較采用獨立樣本資料t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗;OX40 mRNA表達水平與SLEDAI相關性分析采用Spearman檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組OX40、OX40L mRNA在外周血單個核細胞中的表達 SLE組外周血單個核細胞OX40 mRNA水平顯著高于對照組(P＜0.05)，活動期SLE患者外周血單個核細胞OX40 mRNA水平顯著高于非活動期患者和對照組(P＜0.05或＜0.01)。活動期SLE患者組OX40L mRNA水平顯著高于非活動期患者和對照組(P ＜0.05或 ＜0.01)。見表1。

表1 各組OX40、OX40L mRNA在外周血單個核細胞中表達(拷貝/μL，ˉx ±s)

2.2 OX40、OX40L mRNA 表達水平與 SLEDAI的關系 Spearman相關分析顯示，OX40 mRNA表達水平與 SLEDAI呈正相關(r=0.35，P ＜0.05)，而 OX40L mRNA表達水平與SLEDAI無關(P＞0.05)。

3 討論

SLE是一種慢性自身免疫性疾病，屬于風濕性疾病中的彌漫性結締組織病。它可引起全身多個臟器受累，包括皮膚、關節、腎臟、神經系統、血液、漿膜、呼吸和心臟等系統［3］。迄今為止，SLE仍無法根治。但是，隨著早期診斷手段的增多和治療水平的提高，SLE預后明顯改善，SLE的發病機理已經逐漸被人們熟知。

研究顯示，免疫系統調控功能異常在SLE發病過程中具有重要作用，可造成SLE患者系統性病理損害，并引起一系列臨床癥狀。其中，共刺激分子異常表達在自身免疫性疾病的形成和發展中具有重要的促進作用，OX40、OX40L即是其中重要的共刺激分子。OX40屬于腫瘤壞死因子受體/神經生長因子受體家族，為Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量約為50 kD。OX40是一個T細胞活化蛋白，只表達于活化的T細胞表面，且主要在細胞，部分細胞也表達。OX40L是OX40的配體，屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族，是Ⅱ型跨膜蛋白，分子量約為34 kD，OX40L也只在活化的抗原提呈細胞上表達。OX40、OX40L在T細胞的活化、增殖、遷移以及生發中心的形成和DC的分化成熟過程中起重要作用［4］。Farres等［2］研究表明，SLE 患者 OX40+T 細胞百分數顯著高于健康體檢者，這種細胞在腎炎型SLE患者外周血中數量增加的更為顯著。盡管與健康體檢者相比，SLE患者外周血OX40+T細胞的絕對數相差無幾，但是SLE患者表達OX40 T細胞的百分率顯著高于健康體檢者，且與SLE的疾病活動程度密切相關。Manku等［5］證實了OX40在SLE患者的表達，且腎炎型SLE患者的T細胞上OX40的聚焦程度顯著高于非腎炎型SLE患者。Dolff等［6］研究發現，SLE患者OX40表達水平高于健康體檢者，狼瘡腎炎患者OX40表達水平也高于健康體檢者，且腎活檢發現OX40+T細胞浸潤。近年研究還發現，OX40L能協同刺激T細胞的活化，促進B細胞產生高效價抗體，介導OX40+T細胞向炎癥部位浸潤［7］;同時OX40/OX40L在脂多糖等危險信號刺激下，與細胞質內信號傳導分子腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)-2、TRAF-3、TRAF-5 結合，上調核因子(NF)-κB的活性，使 Bcl-2、Bcl-xL等一系列抗凋亡分子高表達來抑制細胞凋亡，繼而維持CD+4T細胞的存活，促進CD+4T細胞穿過血管內皮在炎癥位點募集［8］，從而打破自身耐受參與SLE的發病。這些研究結果均表明，OX40、OX40L與SLE的發病密切相關。

本研究結果顯示，活動期SLE患者外周血單個核細胞OX40、OX40L mRNA表達水平較非活動期SLE患者與健康體檢者明顯升高;OX40 mRNA表達水平與SLEDAI呈正相關。提示共刺激分子OX40變化與SLE疾病的活動性呈一定相關性，其可能在SLE的發病機制及病情進展中起作用。

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［4］Humphreys IR，Loewendorf A，de Trez C，et al.OX40 costimulation promotes persistence of cytomegalovirus-specific CD8 T cells:a CD4-dependent mechanism［J］.J Immunol，2007，179(4):2195-2202.

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