人外周血單核細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究

李 鑫，梁艷紅，韓學(xué)鋒，邵 英，丁海玲，張立平

(1淄博市中心醫(yī)院，山東淄博255000;2山東英才學(xué)院;3山東省郵政公司門診部;4山東杏林科技職業(yè)學(xué)院)

內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)在參與成體血管新生及創(chuàng)傷修復(fù)和缺血性疾病治療等方面發(fā)揮著重要作用［1］，但由于EPCs含量極少，其應(yīng)用受到限制。近年研究發(fā)現(xiàn)，人外周血單核細(xì)胞也具有多向分化潛能［2］，與淋巴管新生有密切聯(lián)系［3］，且其數(shù)量相對(duì)較多，取材較為方便。基于此，2009年10月～2012年7月，我們觀察了人外周血單核細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分化的可能性。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑:胎牛血清(FBS)，Hyclone公司;人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)，天津市灝陽(yáng)生物制品科技有限公司;內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基EGM-2，Lonza公司;L-DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司，人纖維連接蛋白(FN)，Sigma公司;一抗:兔抗人LYVE-1單克隆抗體、兔抗人 Podoplanin單克隆抗體、兔抗人VEGFR-3單克隆抗體、兔抗人vWF單克隆抗體、兔抗人VEGFR-2單克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司;二抗:FITC標(biāo)記羊抗兔多克隆二抗、TRITC標(biāo)記羊抗兔多克隆二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Trition-X 100，北京索來(lái)寶科技有限公司;DAPI熒光染液，碧云天生物技術(shù)研究所;Trizol試劑，Inventrogen公司;Revert Aid First Strand cDNA Synthesis試劑盒，F(xiàn)ermentas公司;DNA Marker和2×EasyTaq PCR SuperMix，北京全式金生物技術(shù)公司;EB，Sigma公司;PE標(biāo)記的CD14抗體、FITC標(biāo)記的CD14抗體、PE標(biāo)記的 CD34抗體、Alexa Fluor647標(biāo)記的Podoplanin抗體、PE標(biāo)記的VEGFR-3抗體、FITC標(biāo)記的LYVE-1抗體，Biolegend公司。主要儀器:Olympus IX70熒光顯微鏡，Olympus公司;PCR儀，Whatman Biometra公司;FC500型流式細(xì)胞儀，BECKMEN-KULTER公司。

1.2 方法

1.2.1 單核細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 采集健康志愿者外周血100 mL(檸檬酸鈉抗凝)，用Ficoll密度梯度離心法分離獲取單個(gè)核細(xì)胞，PBS液洗滌2次，用含15%人血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基EGM-2重懸。EGM-2含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基 EBM和添加物 hFGF、VEGF、R3-IGF-1、ascorbic acid、hEGF、GA-100、heparin和hydrocortisone。調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，接種于用20 ng/mL FN鋪板的6孔板，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，2 d后收集未貼壁細(xì)胞，接種至另一FN鋪板的6孔板中誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3 d換液1次。

1.2.2 VEGFR-3、Podoplanin、LYVE-1、VEGFR-2、vWF的表達(dá)檢測(cè) 采用熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色法。取誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色。用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。細(xì)胞呈紅色或綠色、細(xì)胞核呈藍(lán)色為陽(yáng)性。

1.2.3 Podoplanin、Prox-1、VEGFR-3、LYVE-1、vWF的基因表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。取誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d的細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA。取500 ng RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用Prime Script RT試劑盒在下列條件下合成cDNA:65 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃5 min。取1μL cDNA作模板，依次加入dH2O 10.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上游和下游引物各0.5μL進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35～38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用β-actin做內(nèi)參。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成。PCR引物序列:LYVE-1:上游引物:5'-TTCCATCCAGGTGTCATGCAG-3'，下游引物:5-AAGGGGATGCCACCGAGTAG-3';VEGFR-3:上游引物:5'-AAGTACATCAAGGCACGCATC-3'，下游引物:5'-GCAGTTCAGGACCAGCTTCT-3';VEGFR-2:上游引物:5'-CCGTCAAGGGAAAGACTACG-3'，下游引物:5'-CTTTACCCCAGGATATGGAG-3';Podoplanin:上游引物:5'-GCCAGCCAGAAGATGACACTG-3'，下游引物:5'-GAATGCCTGTTACACTGTTGACAC-3';Prox-1:上游引物:5'-CACCTGAGCCACCACCCTTG-3'，下游引物:5'-GCATTGCACTTCCCGAATAAGGT-3';vWF:上游引物:5'-CACCGTTTGCCCACCCTTCG-3'，下游引物:5'-GCCCACTGGGAGCCGACACT-3';β-actin:上游引物:5'-CCATCTACGAGGGGTATGCCC-3'，下游引物:5'-TCCTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'。

1.2.4 淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取新鮮分離的單核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×107/mL，分別加入PE標(biāo)記的VEGFR-3抗體和FITC標(biāo)記的CD14抗體，4℃孵育40 min，PBS液洗滌2次，離心后棄上清，加入適量PBS重懸混勻后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。取誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d的細(xì)胞，加入2%利多卡因，37℃孵育5～8 min后吹打成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×107/mL，加入PE標(biāo)記的VEGFR-3抗體，按照上述步驟孵育重懸后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。各組均以同型抗體作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 新鮮分離的單個(gè)核細(xì)胞呈小圓形，經(jīng)FN鋪板、EGM-2貼壁培養(yǎng)2 d后細(xì)胞開(kāi)始變大，部分細(xì)胞伸出小的突起或呈橢圓形。7 d時(shí)細(xì)胞伸長(zhǎng)，呈紡錘形或多角形(如圖1A)。誘導(dǎo)培養(yǎng) 7 d的細(xì)胞對(duì) LYVE-1、Podoplanin、VEGFR-3、VEGFR-2及vWF的表達(dá)均為陽(yáng)性(如圖1B～F)。

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變注:A:培養(yǎng)7 d的細(xì)胞形態(tài)，呈紡錘形或多角形(EGM-2培養(yǎng)，×200);B～E:免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，B:VEGFR-3(FITC染色，×200)，C:LYVE-1(TRITC染色，×200)，D:Podoplanin(TRITC染色，×200)，E:vWF(FITC染色，×200)，F(xiàn):VEGFR-2(FITC染色，×200)

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 PCR擴(kuò)增后電泳結(jié)果示，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d的EPCs對(duì)Podoplanin、Prox-1、VEGFR-3、LYVE-1、vWF的基因表達(dá)均為陽(yáng)性，而對(duì)VEGFR-2的基因表達(dá)不恒定，呈弱陽(yáng)性或陰性。見(jiàn)圖2。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果 新鮮分離的單核細(xì)胞經(jīng)流式雙標(biāo)檢測(cè)對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)如下:VEGFR-3為0.1%，培養(yǎng)7 d后的EPCs對(duì)VEGFR-3的表達(dá)率為26.9%。見(jiàn)圖3。

3 討論

圖2 培養(yǎng)7 d的單核細(xì)胞對(duì)淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物和內(nèi)皮共同標(biāo)志物的mRNA表達(dá)情況注:A:VEGFR-3(417 kb)，B:Podoplanin(200 kb)，C:Prox-1(200 kb)，D:LYVE-1(434 kb)，E:vWF(435 kb)，F(xiàn):β-actin(200 kb);Marker 7 條帶依次為100、200、300、400、500、600 和700 kb

圖3 VEGFR-3的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)圖

近年研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞具有多分化的潛能，經(jīng)特定因子定向誘導(dǎo)，能轉(zhuǎn)分化為T細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等［4］。因此，許多學(xué)者對(duì)單核細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，使其轉(zhuǎn)分化為EPCs，并進(jìn)一步分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞［5，6］。人外周血中的單核細(xì)胞來(lái)源豐富且取材方便，如果能作為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的來(lái)源，并用于臨床淋巴水腫的治療，將有很好的應(yīng)用前景。

淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物Prox-1、LYVE-1、Podoplanin、VEGFR-3是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的分子生物學(xué)特性，對(duì)淋巴管內(nèi)皮功能的發(fā)揮、淋巴管的新生等具有重要作用。其中，Pox-1對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的定型及發(fā)育起重要作用［7］;LYVE-1在蛋白和基因水平特異性表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮［8］;Podoplanin作為一種跨膜糖蛋白，在淋巴管內(nèi)皮特異性表達(dá)［9］，VEGFR-3是誘導(dǎo)淋巴管新生的關(guān)鍵蛋白［10］。本課題組以往的研究發(fā)現(xiàn)，許多炎癥細(xì)胞因子短期刺激單核細(xì)胞即能表達(dá)淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物Prox-1和Podoplanin［11］。然而，單核細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)刺激能否進(jìn)一步分化成淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞尚有待研究。本研究在此基礎(chǔ)上，經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后，檢測(cè)了其對(duì)淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物VEGFR-3、Podoplanin、LYVE-1、Prox-1 和內(nèi)皮共同標(biāo)志物vWF、VEGFR-2的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d時(shí)，單核細(xì)胞表達(dá)所有的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物，使其向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的分化成為可能。對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞共同標(biāo)志物vWF表達(dá)陽(yáng)性，對(duì)VEGFR-2 mRNA的表達(dá)則不穩(wěn)定，呈弱陽(yáng)性或陰性。單核細(xì)胞來(lái)源的EPCs表現(xiàn)低增殖能力可能與低表達(dá)VEGFR-2 有關(guān)［12］。

綜上所述，人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的EPCs經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后可以表達(dá)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，但表達(dá)部分內(nèi)皮共同標(biāo)志物，特別是對(duì)VEGFR-2的表達(dá)為弱陽(yáng)性或陰性，還不能稱之為真正的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，需要進(jìn)一步的研究。

［1］Mikirova NA，Jackson JA，Hunninghake R，et al.Circulating endothelial progenitor cells:a new approach to anti-aging medicine［J］.J Transl Med，2009，7:106.

［2］ Kuwana M，Okazaki Y，Kodama H，et al.Human circulating CD14+monocytes as a source of progenitors that exhibit mesenchymal cell differentiation［J］.J Leukoc Biol，2003，74(5):833-845.

［3］Kerjaschki D.The crucial role of macrophages in lymphangiogenesis［J］.J Clin Invest，2005，115(9):2316-2319.

［4］Zhao Y，Glesne D，Huberman E.A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(5):2426-2431.

［5］Rehman J，Li J，Orschell CM，et al.Peripheral blood"endothelial progenitor cells"are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors［J］.Circulation，2003，107(8):1164-1169.

［6］Urbich C，Heeschen C，Aicher A，et al.Relevance of monocytic features for neovascularization capacity of circulating endothelial progenitor cells［J］.Circulation，2003，108(20):2511-2516.

［7］Hong YK，Harvey N，Noh YH，et al.Prox1 is a astmer control gene in the program specifying lymphatic endothelial cell fate［J］.Dev Dyn，2002，225(3):351-357.

［8］Dadras SS，North PE，Bertoncini J，et al.Infantile hemangiomas are arrested in an early developmental vascular differentiation state［J］.Mod Pathol，2004，17(9):1068-1079.

［9］Schacht V，Ramirez MI，Hong YK，et al.T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema［J］.EMBO J，2003，22(14):3546-3556.

［10］Veikkola T，Jussila L，Makinen T，et al.Signalling via vascular endothelial growth factor receptor-3 is suficient for lymphangiogenesis in transgenic mice［J］.EMBO J，2001，20(6):1223-1231.

［11］王長(zhǎng)明，田鏵，梁艷紅，等.單核細(xì)胞被誘導(dǎo)表達(dá)淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009，47(11):85-88.

［12］ Dimmeler S.Circulating endothelial precursors:Identification of functional subpopulations［J］.Blood，2005，106(7):2231-2232.