銅負荷大鼠腦組織Cu、Zn、Fe分布及其對神經元細胞損傷的機制

王佳煒，侯煥喜，王 訓，吳君霞，程 楠，韓詠竹，胡紀源，楊任民

(1安徽中醫學院，合肥230038;2淮北礦工總醫院;3安徽中醫學院神經病學研究所附屬醫院)

Cu是機體必需微量元素之一，對維持神經系統的正常結構和生理功能具有重要作用。但當Cu攝取過多或由于遺傳因素所致的Cu 在體內蓄積會導致體內Cu代謝相關酶和蛋白質的活性受抑制，繼而影響肝、腦、腎等臟器的功能。Cu負荷大鼠模型可以較好地模擬肝Cu沉積誘導肝損傷的病理過程，且具有簡單實用、重復性好等特點，是研究Cu代謝障礙性疾病較為理想的動物模型［1］。我們在前期研究［2］中發現，Cu負荷大鼠模型血清及肝組織Cu含量較對照組均明顯增高，血清ALT也明顯升高，提示肝臟Cu的沉積可影響肝功能。由于許多Cu代謝障礙性疾病患者除了有肝損害外，還可表現為神經系統癥狀。為此，2012年6～10月，我們觀察了Cu負荷大鼠不同腦區腦組織Cu、Zn、Fe的分布及腦組織氧化應激指標的改變，為研究Cu對神經元細胞損傷的機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠50只，3月齡，體質量(210±25)g，由安徽省實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(皖)2011-002。飼養于安徽中醫學院神經病學研究所動物房，飼養條件:每日光照14 h、黑暗10 h，室溫(20±2)℃中籠養。微量分析天平(TG332，上海天平儀器廠)，微量移液器(Finnpipette，芬蘭)，微波消解儀(WX-3000，上海屹堯儀器科技發展有限公司)，等離子體質譜儀(XSERAESⅡ，美國熱電公司)，等離子體光譜儀(ACAT-6300，美國熱電公司)，超低溫冰箱、普通冰箱(榮事達冰箱廠)，可控恒溫水浴鍋(GKC8214型，江蘇通州實驗儀器廠)，低速臺式離心機(DKDC-40，科大創新股份有限公司)，漩渦混勻器(XH-B，江蘇康健醫療用品有限公司)，微量振蕩器(BL-2DQ-OA，YDME)，分光光度儀(Biotecnica-instrument，S.P.N)，日立全自動生化分析儀(7020型，日本)。超純水、超純濃硝酸Ⅳ～Ⅴ級(北京化工廠)，丙二醛(MDA)試劑盒、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 Cu負荷大鼠模型的建立 隨機將大鼠分為模型組、對照組各25只。模型組給予含硫酸銅1 g/kg的粉狀飼料和0.185%硫酸銅水，對照組給予正常喂食、飲水，喂養4周。與對照組比較，模型組體質量增長明顯緩慢，皮毛欠光澤，飲食、飲水量明顯減少，容易激惹，且出現肢體強直扭轉，即為造模成功。

1.2.2 不同腦區腦組織Cu、Zn、Fe含量的測定 繼續喂養至第12周結束，對照組全部存活，模型組存活23只。隨機選取模型組10只、對照組11只，腹腔內注射10%水合氯醛麻醉后，打開其腹腔，腹主動脈取血后，經3 000 r/min離心10 min后，取血清置入EP管中，待測Cu/Zn-SOD、MDA;然后經開顱，在冰上小心取出腦組織。經雙蒸水反復沖洗表面血液后，以濾紙吸干表面水分，分別稱取額葉、頂葉、顳葉、頂葉、枕葉、基底結區、腦干及小腦組織各0.2 g，送安徽地質實驗研究所行微波消解，以等離子體原子發射光譜法檢測各腦區組織Cu、Zn、Fe含量。

1.2.3 血清、不同腦區腦組織中Cu/Zn-SOD、MDA的測定 第12周結束時，隨機選取模型組9只、對照組11只，腹腔內注射10%水合氯醛深麻后，打開其腹腔，腹主動脈取血后，經3 000 r/min離心10 min后，取血清置入 EP管中，待測 Cu/Zn-SOD、MDA。分別選取9只在冰上小心取出腦組織。用上述方法取出腦組織用冰冷生理鹽水沖洗干凈表面血液，再用用濾紙吸干表面水分，然后稱取大腦皮層及基底節區組織各0.3 g，加入冰冷生理鹽水制成10%的勻漿液，3 000 r/min離心15 min，取上清液置入EP管中，待測各腦區組織Cu/Zn-SOD、MDA。MDA含量通過硫代巴比妥酸比色法測定，Cu/Zn-SOD通過黃嘌呤氧化酶法測定。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，結果比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組不同腦區腦組織Cu、Zn、Fe含量比較見表1。

表1 兩組不同腦區腦組織Cu、Zn、Fe含量比較(μg/g，ˉx ± s)

2.2 兩組血清Cu/Zn-SOD、MDA比較 見表2。

表2 兩組血清Cu/Zn-SOD、MDA比較(ˉx±s)

2.3 兩組腦組織Cu/Zn-SOD、MDA比較 見表3。

3 討論

細胞內Cu的穩態對維持機體正常的生理功能具有重要意義。當體內蓄積的Cu超過了組織臟器中各種細胞器含銅蛋白質負載能力時，可對細胞產生毒性，引起膜脂質過氧化、線粒體損傷、溶酶體破裂，繼而引起肝臟和神經系統的損害。

表3 兩組腦組織Cu/Zn-SOD、MDA比較(ˉx±s)

我們前期研究［2］顯示，隨著喂養時間的延長，Cu負荷模型大鼠肝、腦組織Cu、Zn含量均顯著高于對照組，血清ALT和Cu繼續增高，肝組織Cu含量也明顯增加，提示ALT升高可能與肝Cu沉積對肝細胞功能影響有關。本研究中Cu負荷大鼠腦組織各功能區的Cu含量均明顯升高，其中以基底節區、小腦、腦干Cu含量的升高尤為顯著，說明當Cu負荷時這些腦功能區可能受損更加明顯。

Cu對神經系統的損傷機制尚未完全闡明。目前認為，與氧化應激、金屬蛋白/酶功能改變、細胞信號轉導機制等有關，而氧化應激是其最重要的機制之一。已有的研究表明，中樞神經元與其他系統不同，在神經細胞膜脂筏中鞘磷脂特別豐富，Cu誘導神經細胞膜的脂質過氧化損傷更重，激發一系列的氧化應激反應［3］。脂質過氧化物分子在生理狀態下非常穩定，但當有金屬離子存在時，則會產生脂質過氧化反應。而Cu作為參與組成動物機體內幾種抗氧化酶與蛋白(Cu/Zn-SOD、MTs)的輔助因子，其作用是催化反應性氧類形成膜脂質過氧化反應。氧自由基生成過多或體內抗氧化物濃度不足是機體發生發生氧化應激的原因所在。

Zn存在于所有生物體中，參與體內多種生理活動，具有廣泛的生理功能。在生物體內，Zn對機體抗氧化體系有重要作用，它能防止細胞膜氧化、減少超氧陰離子形成。機體在Zn缺乏時，會導致脂質過氧化加強，誘發機體產生氧化損傷，而補Zn能使該損傷得以恢復［4，5］。Zn能減少鐵離子進入細胞，并抵制其在羥自由基引發的鏈式反應中的催化作用。本研究結果顯示，Cu可能通過影響Zn在體內的穩態平衡而可能導致神經元細胞調亡壞死。其機制可能是缺Zn降低Cu/Zn-SOD活力，使機體發生氧化應激，神經細胞變性死亡，最終導致神經變性疾病，而Zn的生理功能較為廣泛，亦有可能從其他途徑參與神經變性疾病。

Cu/Zn-SOD是機體活性氧清除反應過程中第一個發揮作用的抗氧化酶，對防止氧自由基破壞細胞的組成、結構和功能，保護細胞免受氧化損傷具有重要的作用。研究表明，Cu含量增高時，Cu/Zn-SOD含量下降，脂質過氧化反應增強，氧自由基含量增加，最終導致神經細胞數量減少［6］。本研究結果顯示，過量Cu可以導致大鼠血清、大腦基底節區及皮質組織Cu/Zn-SOD活力明顯降低。MDA是氧自由基和生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的終產物，測定MDA可間接反應機體自由基產生的量和體內脂質過氧化反應的程度［7，8］。本研究中模型組血清及大腦組織中MDA含量明顯高于對照組，說明Cu負荷大鼠體內脂質過氧化水平增高，與文獻報道［9］基本一致。

綜上所述，體內過量Cu會導致血液與組織中Cu/Zn-SOD活力下降及MDA含量增高，使體內自由基蓄積，引起脂氧化，導致肝臟、腦等組織損傷。由于生物體內的氧化應激反應是一個涉及眾多環節的復雜病理生理過程，過量Cu及Zn、Fe不足參與神經元細胞氧化應激的具體環節和詳細機制有待進一步深入研究。

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