iTRAQ聯合LC-MS/MS技術在肺腺癌血漿生物標志物篩選中的應用

覃慧嬋，柳廣南，蘇 紅，張建全，傅鈺雁

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

原發性支氣管肺癌簡稱肺癌，為最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率都有逐年增高的趨勢。目前，肺癌的臨床診斷主要依靠影像學(胸部X線片和CT)、細胞病理學(痰脫落癌細胞)和組織學(病理切片)等檢查。這些傳統的診斷方式雖在臨床上應用多年，但往往不能早期發現肺癌，以致于80%肺癌患者在就診時已喪失手術機會。因此，早期發現、早期診斷和早期治療是提高肺癌生存率的關鍵。肺癌依據其病理類型分為兩大類:小細胞肺癌及非小細胞肺癌，而非小細胞肺癌又分為鱗癌、腺癌、大細胞癌等;近年來，肺腺癌的發病率有不斷上升的趨勢，但其癌變機制仍不十分明確，尚缺乏有效的用于肺腺癌早期診斷和預后監測的生物標志物。同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)聯合液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)技術是近年來開發的一種新的蛋白質組學定量技術，是一種理想的尋找生物標志物的技術［1］，已被應用于乳腺癌、前列腺癌、子宮內膜癌等血清標志物的研究［2～4］。本研究旨在應用iTRAQ聯合LC-MS/MS技術篩選出用于診斷肺腺癌的血漿生物標志物。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選擇2011年9月～2012年9月在廣西醫科大學第一附屬醫院住院的肺腺癌患者10例(腺癌組)，男5例、女5例，年齡35～70(53．80±11．54)歲，均經病理學檢查確診，且均未行放療或化療;選擇同期健康體檢者10例(正常組)，男5例、女5 例，年齡30～70(52．36 ±10．17)歲。兩組研究對象在性別、年齡上差異均無統計學意義(P均＞0．05)，兩組血漿標本獲得均經過患者或家屬知情同意。

1．2 方法

1．2．1 血漿標本的采集與保存 所有血漿樣品為清晨空腹時使用抗凝管采集，在4℃下以3 000g離心10 min，收集上清液，冰上分裝后－80℃冰箱保存備用。

1．2．2 去除血漿高豐度蛋白 兩組血漿樣品均進行組內等體積混合，然后按照Proteominer試劑盒的操作步驟去除血漿高豐度蛋白，并采用Brandford法測定蛋白含量;取 0．5μg/μL蛋白上樣，行 SDSPAGE，檢測樣品中高豐度蛋白的去除情況。

1．2．3 蛋白酶解及iTRAQ標記 每組精確取出100μg蛋白，蛋白∶酶按20∶1的比例加入Trypsin，37℃酶解4 h。按上述比例再補加1次Trypsin，37℃繼續酶解8 h。胰蛋白酶消化后，用真空離心泵抽干肽段;用0．5 mol/L TEAB復溶肽段，按照手冊進行iTRAQ;兩組肽段被不同的iTRAQ標簽標記(正常組以113標記，腺癌組以118標記)后，室溫培養2 h。

1．2．4 SCX強陽離子交換柱分離蛋白 將標記后的兩組肽段混合，采用島津LC-20AB液相系統、分離柱為4．6 mm×250 mm型號的SCX柱對樣品進行液相分離。將標記后抽干的混合肽段用4 mL buffer A(25 mmol/L NaH2PO4，25%CN，pH 2．7)復溶。進柱后以1 mL/min速率進行梯度洗脫:先用buffer A洗脫10 min，再逐漸混入5% ～35%buffer B(25 mmol/L NaH2PO4，1 mol/L KCl，25%ACN，pH 2．7)洗脫11 min，最后逐漸混入35% ～80%buffer B洗脫1 min。整個洗脫過程在214 nm吸光度下進行監測，經過篩選得到20個組分。每個組分分別用StrataX除鹽柱除鹽，然后冷凍抽干。

1．2．5 基于 Triple TOF 5600的 LC-ESI-MS/MS分析 與質譜儀相結合的液相系統為nanoACQuity(Waters)，包括 Symmetry C18柱(規格 5 μm，180 μm ×20 mm)和 BEH130 C18柱(規格1．7 μm，100 μm×100 mm)兩部分。Symmetry C18柱用于肽段吸附和除鹽，BEH130 C18柱用于分離。所用的流動相A液(水∶乙腈∶甲酸=98∶2∶0．1)和B 液(水∶乙腈∶甲酸=2∶98∶0．1)中都加入一定比例的校正液。每次上樣量為2．25μg(9μL)，用A液以2 μL/min的流速洗脫15 min，進行肽段吸附和除鹽。接下來用含5%B液的流動相以300 nL/min流速洗脫1 min，開始建立洗脫梯度:40 min內B液梯度線型從5%升至35%，再5 min從35%升至80%，然后80%持續洗脫5 min，最后2 min恢復柱料。使用的機器為 TripleTOF 5600(AB SCIEX，Concord，ON)，離子源為 NanosprayⅢ source(AB SCIEX，Concord，N)，放射器為石英材料拉制的噴針(New Objectives，Woburn，MA)。數據采集時，機器的參數設置如下:離子源噴霧電壓2．5 kV，氮氣壓力為30 psi(14．5 psi≈1 bar)，噴霧氣壓 15 psi，噴霧接口處溫度150℃;掃描模式為反射模式，分辨率≥30 000;積累250 ms的從2+到5+的離子挑選其中強度每秒積累超過120分的前30個進行掃描，3．3 s為1個循環;第2個四極桿(Q2)的傳輸窗口設置為100 Da為100%;脈沖射頻電的頻率為11 kHz;檢測器的檢測頻率為40 GHz;每次掃描的粒子信號以4個通道分別記錄共4次后合并轉化成數據;對于iTRAQ類項目，離子碎裂的能量設置為(35±5)eV;母離子動態排除設置:在一半的出峰時間內(約18 s)，相同母離子的碎裂不超過2次。

1．2．6 數據庫檢索及生物信息學分析 用Mascot 2．3．02蛋白質鑒定軟件對數據庫 IPI:homo(91464sequences)，V-3．87 進行搜索，軟件依據同位素報告基團的相對含量進行蛋白質定量，以報告基團113為參照，選擇差異顯著(P≤0．05)的結果進行報告。以比值＞1．50或＜0．67作為閾值選取差異蛋白。鑒定得到的蛋白進行基因功能聚類分析(GO)及基因路徑分析。

2 結果

2．1 質譜鑒定結果 質譜共鑒定到蛋白369個，其中差異表達的蛋白有35種，腺癌組較正常組上調的蛋白有21種，下調的蛋白有14種。見表1。

表1 腺癌組與正常組比較上調比值＞1.50或下調比值＜0.67的蛋白

2．2 生物學功能分析 本研究對369個通過鑒定的蛋白進行GO分析及pathway分析。結果發現，這369個蛋白分別參與了26個生物學過程，有18種分子功能，參與52個生物代謝通路。排名前3位的生物學過程為免疫與防御(13．6%)、發育過程(11．7%)、分子轉運(9．4%)，分子功能為結合功能蛋白(15．7%)、催化功能蛋白(12．5%)、轉運蛋白(9．3%)，生物代謝通路為炎癥信號通路(25．6%)、整合素信號通路(11．9%)、凋亡信號通路(5．7%)。

3 討論

肺腺癌多數起源于較小的支氣管，為周圍型肺癌，故早期一般沒有明顯的臨床癥狀，許多患者在就診時已喪失最佳治療時機。因此，越來越多的研究致力于尋找肺腺癌早期生物標志物以助診斷，近年來，iTRAQ聯合LC-MS/MS技術已經逐漸成為差異蛋白質組學定量研究的主要工具之一，廣泛應用于腫瘤標志物的發現、常見疾病差異表達蛋白質的鑒定，有利于闡明疾病的發生機理，對疾病的預防、診斷、預后和療效監測具有重要作用，并有助于用作靶點來開發臨床治療藥物。

iTRAQ聯合LC-MS/MS技術在肺腺癌的研究方面已取得一定的成果。Chuncg等［5］應用iTRAQ聯合LC-MS/MS技術篩選12例肺腺癌及癌旁正常組織的差異蛋白，并應用免疫組化的方法進行鑒定，發現AGR2有望成為肺腺癌潛在的腫瘤標志物。Keshamouni等［6］應用 iTRAQ 聯合 LC-MS/MS 技術鑒定出了腫瘤壞死因子-β(TGF-β)誘導肺腺癌細胞株A549上皮間葉轉化的相關蛋白質，發現了許多與細胞遷移、黏附和浸潤作用有關的蛋白質。張薇等［7］應用iTRAQ標記技術聯合LC-MS/MS方法篩選肺腺癌細胞株、小細胞肺癌細胞株和人正常支氣管上皮細胞株的差異蛋白，發現HSP90和波形蛋白有望成為肺腺癌的候選腫瘤標志物。

本研究采用iTRAQ聯合LC-MS/MS技術篩選肺腺癌組與正常組血漿差異蛋白，共鑒定差異表達的蛋白有35種，腺癌組較正常組上調的蛋白有21種，下調的蛋白有14種，其中，SCGB3A2、SFTPB表達顯著上調。SCGB3A2又稱子宮珠蛋白相關蛋白1(UGRP-1)，在免疫調節和抗炎活動中起著重要的調節作用，因此SCGB3A2的表達水平可能對疾病的診斷及預后效果的評價有一定的指導作用。目前，關于SCGB3A2在肺腺癌方面的研究甚少Kurotani等［8］通過免疫組化的方法檢測到SCGB3A2在肺腺癌患者中高表達，提示SCGB3A2有望成為肺腺癌的生物標志物;而國內尚未見SCGB3A2在肺腺癌研究方面的報道。本研究中發現SCGB3A2在肺腺癌組血漿中的表達顯著高于正常組，說明SCGB3A2在肺腺癌的癌變過程中起一定作用，有進一步研究的價值。

SFTPB即表面活性蛋白B，主要由肺泡Ⅱ型細胞合成和分泌，是肺表面物質形成所必需的物質，與肺的發育過程密切相關，其遺傳缺陷與NRDS、急性呼吸窘迫綜合征、先天性肺泡蛋白沉積癥、成年慢性阻塞性肺氣腫等呼吸系統疾病相關聯。Sumita等［9］研究發現，SFTPB基因敲除小鼠和SFTPB基因突變新生兒出生后死于呼吸窘迫。而SFTPB表達與肺腺癌是否存在關聯，國內外僅有幾篇報道，Xi等［10］研究發現，SFTPB在肺腺癌及肺鱗癌組織中表達均增高。本研究發現SFTPB在肺腺癌組血漿中表達明顯高于正常組，提示SFTPB在肺腺癌的發病中可能發揮作用。

總之，本研究應用iTRAQ聯合LC-MS/MS技術能很好地進行了肺腺癌的差異蛋白質組學分析，能一次性篩選出35種與肺腺癌相關的差異蛋白，并能對其進行定性及相對定量;對篩選出的差異蛋白進行生物信息學分析，還能了解其參與的生物學過程及代謝通路等，為肺腺癌的發病機制提供新的線索;本研究中篩選出的表達有顯著差異的蛋白SCGB3A2、SFTPB有望成為潛在的肺腺癌血漿生物標志物，值得進一步研究。

［1］ Melanson JE，Avery SL，Pinto DM．High-coverage quantitative proteomics using amine-specific isotopic labeling［J］．Proteomics，2006，6(16):4466-4474．

［2］Bouchal P，Roumeliotis T，Hrstka R，et al．Biomarker discovery in low-grade breast cancer using isobaric stable isotope tags and two-dimensional liquid chromat ography-tandem mass spectrometry(iTRAQ-2DLC-MS/MS)based quantitative proteomic analysis［J］．J Proteome Res，2009，8(1):362-373．

［3］Glen A，Gan CS，H amdy FC，et al．iTRAQ-facilitated proteomic analysis of human prostate cancer cells identifies proteins associated with progression［J］．J Pr oteome Res，2008，7(3):897-907．

［4］ DeSouza L，Diehl G，Rodrigues MJ，et al．Search for cancer markers from endometrial tissues using differentially labeled tags iTRAQ and cIC AT with mul tidimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry［J］．JProteome Res，2005，4(2):377-386．

［5］Chung K，Nishiyama N，Wanibuchi H，et al．AGR2 as a potential biomarker of human lung adenocarcinoma［J］．Osaka City Med J，2012，58(1):13-24．

［6］ Keshamouni VG，Michailidis G，Grasso CS，et al．Differential protein expression profiling by iTRAQ-2DLC-MS/MSof lung cancer cells undergoing epithelial-mesenchymal transition reveals a migratory/invasive phenotype［J］．J Proteome Res，2006，5(5):1143-1154．

［7］張薇，楊拴盈，李維，等．肺癌細胞系和正常人支氣管上皮細胞系線粒體差異表達蛋白質的定量研究［G］．第十二次全國呼吸病學學術會議論文匯編，2011:132．

［8］Kurotani R，Kumaki N，Naizhen X，et al．Secretoglobin 3A2/uteroglobin-related protein 1 is a novel marker for pulmonary carcinoma in mice and humans［J］．Lung Cancer，2011，71(1):42-48．

［9］Sumita Y，Sugiura T，Kawaguchi Y，et al．Genetic polymorphisms in the surfactant proteins in systemic in Japanese:T/Tgenotype at 1580C/T(Thr131Ile)in the SP-P gene reduces the risk of interstitial lung disease［J］．Rheumatologyy，2008，47(3):289-291．

［10］Xi L，Coello MC，Litle VR，et al．A combination of molecular markers accurately detects lymph node metastasis in non-small cell lung cancer patients［J］． Clin Cancer Res，2006，12(8):2484-2491．