SD大鼠骨髓基質干細胞體外誘導成骨分化實驗研究

曾鐵功，趙晉英，黃澤智

(邵陽醫學高等專科學校，邵陽市分子生物學重點實驗室，湖南邵陽422000)

傷殘肢體的完美修復，一直是人類的夢想，以干細胞工程為代表的現代組織工程學無疑為人類提供了新的期望［1］。骨髓基質干細胞(BMSCs)是存在于骨髓中的一類具有自我更新和多向分化潛能的干細胞，在體內外適當的誘導條件下可分化為骨、軟骨、脂肪、神經等多種組織。BMSCs移植具有簡單、實用、費用低和無免疫排斥等優點，成為目前解決大塊骨缺損修復最有前景的手段之一［2］。2012年1～8月進行本實驗，旨在探討BMSCs這類種子細胞成骨分化的條件，為后期骨組織修復工程研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 4周齡清潔級SD大鼠8只，由南華大學實驗動物中心提供。

1．1．2 主要試劑 DMEM-LG培養基(美國 Gibco公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物公司)，胰酶(北京鼎國生物公司)，BCIP/NBT堿性磷酸酶(ALP)染色試劑和MTT試劑(北京鼎國生物公司)，茜素紅(天津大茂化學試劑廠)。

1．2 方法

1．2．1 BMSCs的分離及體外培養 運用全骨髓貼壁法。清潔級4周齡SD大鼠，脫頸處死;75%乙醇浸泡10 min，剝離雙股骨表面組織;無菌DMEM沖洗，剪斷骨兩端后，大號注射器吸取DMEM液(10%FBS，100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和20 U/mL肝素)沖洗髓腔;收集骨髓于一離心管，反復吹打，180 g×5 min離心;下層細胞層經DMEM液混勻后接種于25 mL培養瓶，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養。48 h首次換液，以后3 d換液1次。待細胞密度達80%，棄培養液;用PBS輕沖3遍，加入2．5 g/L胰蛋白酶消化、傳代。傳代時細胞接種密度1×104/cm2，收集第3代細胞備用，隨機分為實驗組及對照組。

1．2．2 成骨誘導液配制 在DMEM培養液中加入地塞米松(Dex)1×10-7mol/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L和Vit-C 1×10-6mol/L，誘導實驗組BMSCs向成骨細胞分化。

1．2．3 細胞生長觀察 在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，鏡檢拍照。

1．2．4 細胞爬片ALP染色 在6孔板上每孔滴少量培養基，無菌操作每孔放入1張預處理的蓋玻片;按1×104/cm2接種第3代BMSCs，補足含10%FBS的DMEM培養液2．5 mL/孔;待貼壁2 d后，實驗組換成骨誘導液繼續培養，以后3 d換液1次。分別在第3、6、10天，取出玻片經預冷 PBS洗2遍，冷4%多聚甲醛固定20 min;PBS沖洗后，用BCIP/NBT試劑37℃染色30 min;水洗，脫水透明，中性樹膠封片后鏡檢。藍色顆粒為陽性染色，鏡檢拍照。對照組不加誘導液，細胞爬片染色同實驗組。

1．2．5 MTT比色法繪制細胞生長曲線 哺乳動物活細胞與噻唑藍作用后產生紫色結晶，用二甲基亞砜溶解結晶后，在波長570 nm處測定該溶液光吸收值，可間接反映活細胞增殖能力。以1×104/cm2接種細胞于96孔板，實驗組每孔加入200μL誘導液，對照組加等量基礎培養液。置5%CO2孵箱中培養，3 d換液1次。每天取1板，用MTT法測每孔吸光度值，共8 d。以時間為橫坐標，吸光度均值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1．2．6 成骨鈣化茜素紅染色 6孔板上實驗組與對照組連續培養13 d后，細胞爬片行茜素紅染色。4%多聚甲醛固定30 min，水洗;茜素紅染色30 min，脫水透明，封片后鏡檢。礦化結節被染成深紅色。

1．2．7 統計學方法 采用SPSS11．5統計軟件。數據用±s表示，計量資料組間比較采用t檢驗。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 細胞生長增殖、形態變化 培養的大鼠原代BMSCs 24～36 h開始貼壁，48～72 h貼壁細胞呈短梭形;4～5 d時細胞集落明顯，細胞主要為短梭形成纖維樣細胞，部分為多邊形上皮樣細胞，另外混雜圓形的非貼壁細胞，經換液逐漸清除。原代細胞生長較慢，10 d后細胞匯合達80%以上。傳代細胞4～6 h迅速貼壁、伸展，恢復梭形，10 h左右細胞呈均勻生長，形態較為一致，以細長梭形為主。5～6 d后融合為單層，長滿瓶底，培養過程中未見明顯白色結節形成。實驗組在成骨誘導條件下，細胞在培養過程中向梭性、多角形轉化，有的帶有數個突起，排列漸變不規則。細胞生長逐漸密集融合成團，10 d左右呈復層生長，形成多層細胞;以后逐漸形成多個散在的島狀致密細胞群，呈旋渦狀，中間細胞排列緊密模糊，逐漸形成白色鈣化結節。插頁Ⅱ圖4。

2．2 細胞生長曲線 對照組BMSCs傳代接種第1天后細胞數量即開始增加，第4天增加幅度最大，至第7天細胞數量最大，以后數量略有下降，未出現指數增長期。傳代培養對數增殖期為2～6 d，第7天細胞生長緩慢，進入平臺期。實驗組經成骨誘導的BMSCs增殖速度明顯落后于前者，也未出現指數增長期。見圖1。

圖1 細胞生長曲線

2．3 細胞爬片ALP染色 對照組陽性細胞較少，呈稀疏條索狀;而實驗組誘導后陽性細胞數隨時間的延長明顯增多，鏡下見大部分細胞質內有藍色顆粒狀或片狀沉淀，見封三圖5。第10天，隨機取10個視野計算結果顯示，實驗組ALP染色陽性率為88．34% ±8．65%，而對照組為28．14% ±5．38%，P ＜0．01。

2．4 成骨鈣化茜素紅染色情況 實驗組第13天可見橘紅色的鈣結節，為茜素紅與鈣鹽形成的橘紅色復合物。對照組幾乎無色。見封三圖6。

3 討論

本實驗通過對大鼠BMSCs分離純化、體外培養和誘導分化的研究，為BMSCs作為骨組織工程的種子細胞提供實驗室依據。目前分離純化BMSCs的方法主要有4種，即全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、流式細胞儀和免疫磁珠法［3，4］。本實驗采用全骨髓貼壁法，該法操作簡便，僅通過換液和傳代篩選，便可獲得較多BMSCs，且早期保留了骨髓中的其他成分，可為BMSCs的生長創造了良好的環境。在本實驗中，培養的原代細胞8～10 d便可貼壁生長連接成片，形態主要為短梭形成纖維樣細胞。原代細胞生長較慢，傳代細胞生長快，細胞形態較為一致。傳代5～6 d后可融合為單層，長滿瓶底。BMSCs原代和傳代培養細胞生長特性，與國內外文獻報道基本一致［5，6］。

部分體外培養的BMSCs能自發分化為成骨細胞，但大部分不表達或低表達ALP，分泌的鈣含量也很低，要想其穩定地向成骨分化，需加以誘導［7］。本實驗參考Coelho等的方法，通過加入Dex、β-甘油磷酸鈉、Vit-C對BMSCs進行體外誘導［8］。實驗發現，常規培養BMSCs增殖較快;經誘導后增殖速度顯著下降，細胞匯合時間明顯延長，進一步證明了適當濃度的Dex抑制BMSCs的增殖［9］。這也提示要想獲得分化細胞的穩定增長，接種細胞的基數要有保證。本實驗中誘導后細胞大多向梭性、多角形轉化，排列漸變不規則，細胞生長逐漸密集;10 d左右呈復層生長，以后逐漸形成多個散在的島狀致密細胞群，中間細胞排列緊密模糊，形成白色鈣化結節。其原因可能為誘導液中Dex促進胞外膠原合成［10］;β-甘油磷酸鈉可為BMSCs分化和增殖提供磷原子，促進生理性鈣鹽沉積;Vit-C也促進膠原合成，增加鈣鹽沉積等［11］。但本實驗中鈣結節形成時間與文獻報道有差異［8］，這可能與細胞接種密度及3種誘導劑濃度差異有關。

在細胞培養中，ALP是成骨細胞分化的早期指標，是成骨細胞標志酶之一［12］;而骨礦化結節可作為成骨細胞分化的中期指標，被認為在維持正常骨鈣化率和抑制軟骨鈣化中起作用［11］。因此，本實驗采用這兩項基本指標，考察分化細胞的成骨特性。在實驗時發現，常規培養BMSCs僅有少量ALP陽性細胞，培養10 d時僅占28．14% ±5．38%，茜素紅染色未發現鈣化結節;而誘導的BMSCs，ALP陽性細胞隨時間的延長明顯增多，10 d陽性率達88．34% ±8．65%，在13 d時有顯著密集的鈣化結節。這表明Dex、β-甘油磷酸鈉、Vit-C體外誘導BMSCs向成骨細胞分化良好，并已獲得成熟成骨細胞的表型特征。

綜上所述，本實驗所采用的體外分離培養法，經Dex、β-甘油磷酸鈉、Vit-C 聯合誘導后，BMSCs能穩定地向具有成骨細胞特征的細胞分化，并能體外成骨，可作為成骨細胞的一種來源，但在真正應用于臨床之前還有許多亟待解決的問題［13，14］，仍需進一步通過動物體內實驗來證實它的穩定性和安全性。

［1］Shekkeris AS，Jaiswal PK，Khan WS．Clinical applications of mesenchymal stem cells in the treatment of fracture non-union and bone defects［J］．Curr Stem Cell Res Ther，2012，7(2):127-133．

［2］Aldahmash A，Zaher W，Al-Nbaheen M，et al．Human stromal(mesenchymal)stem cells:basic biology and current clinical use for tissue regeneration［J］．Ann Saudi Med，2012，32(1):68-77．

［3］劉巧云，易黎．骨髓基質細胞分離培養、體外向神經細胞誘導分化及其在中樞神經系統疾病中的研究進展［J］．神經損傷與功能重建，2010，5(2):139-142，146．

［4］Srouji S，Ben-David D，FromiguéO，et al．Lentiviral-mediated integrinα5 expression in human adult mesenchymal stromal cells promotes bone repair in mouse cranial and long-bone defects［J］．Hum Gene Ther，2012，23(2):167-172．

［5］李雪峰，劉亮，王東．大鼠骨髓間充質干細胞體外向成骨細胞分化培養的生物學特性［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2011，15(23):4185-4188．

［6］Gr?ssel S，St?ckl S，Jenei-Lanzl Z．Isolation，culture，and osteogenic/chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells［J］．Methods Mol Biol，2012，879:203-267．

［7］Abdallah BM，Kassem M．Human mesenchymal stemcells:frombasic biology to clinical applications［J］．Gene Ther，2008，15(2):109-116．

［8］Coelho MJ，Fernandes MH．Human bone cell cultures in biocompatibility testing．Part Ⅱ:effect of ascorbic acid，beta-glycerophosphate and dexamethasone on osteoblastic differentiation［J］．Biomaterials，2002，21(11):1095．

［9］Rickard DJ，Sullivan TA，Shenker BJ，et al．Induction of rapid osteoblast differentiation in rat bone marrow stromal cell cultures by dexamethasone and BMP-2［J］．Dev Biol，1994，161(1):218-228．

［10］Kumar S，Ponnazhagan S．Mobilization of bone marrow mesenchymal stem cells in vivo augments bone healing in a mouse model of segmental bone defect［J］．Bone，2012，50(4):1012-1018．

［11］Hicok KC，Thomas T，Gori F，et al．Development and characterization of conditionally immortalized osteoblast precursor cell lines from human bone marrow stroma［J］．JBone Miner Res，1998，13(2):205-217．

［12］Marom R，Shur I，Solomon R，et al．Characterization of adhesion and differentiation markers of osteogenic marrow stromal cells［J］．JCell Physiol，2005，202(1):41-48．

［13］鄭瑜謙，袁芳，閆福華，等．凍存骨髓基質細胞復合材料體內成骨基質的合成能力［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2011，15(12):2275-2278．

［14］Kodama A，Kamei N，Kamei G，et al．In vivo bioluminescence imaging of transplanted bone marrow mesenchymal stromal cells using a magnetic delivery system in a rat fracture model［J］．JBone Joint Surg Br，2012，94(7):998-1006．