CASP3基因多態性與川崎病及其冠狀動脈損害易感性的關系

陳 偉，張宏艷，林書祥

(1天津醫科大學研究生院，天津300070;2天津市兒童醫院)

川崎病是一種免疫介導的兒童急性血管炎綜合征，主要侵襲全身中型肌動脈，其中以冠狀動脈受累最為嚴重，它可致冠狀動脈擴張、冠狀動脈瘤、狹窄甚至閉鎖，已經成為許多國家兒童獲得性心臟病的最常見原因［1］，其發病率近年來呈上升趨勢［2，3］。國外研究表明，川崎病發病具有種族差異性和遺傳易感性［3，4］。編碼半胱天冬蛋白酶 3(Caspase-3)基因CASP3與川崎病易感性的相關性研究成為熱點課題［5～8］，國內目前尚未見報道。本研究通過采用聚合酶鏈反應(PCR)對川崎病患兒及對照組兒童外周血CASP3 rs113420705位點基因多態性進行分析，旨在探討CASP3基因多態性在中國漢族兒童中與川崎病及其冠狀動脈損害(CAL)之間的關系。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 川崎病組:2010年10月～2012年4月在天津市兒童醫院就診的川崎病患兒40例，均符合日本厚生省川崎病研究課題組第5版修訂川崎病診斷標準［2］，年齡2 個月 ～8歲(2．10 ±1．83)歲，男26例，女14例。受試者按冠狀動脈損害標準［9］分為冠狀動脈損害組(17例)和無損害組(23例)。對照組:天津市兒童醫院健康體檢兒童30例，年齡(2．32±1．75)歲，男18例，女12例，除外感染性疾病、免疫系統疾病、川崎病等疾病家族史。所有入組成員為漢族，籍貫為天津、河北及山東，在性別、年齡等方面無顯著性差異(P均＞0．05)，具有可比性。本研究采取標本時獲得所有患兒監護人的知情同意，并獲得了天津市兒童醫院倫理委員會的批準。

1．2 方法

1．2．1 CASP3 rs113420705位點基因多態性檢測收取受試者(川崎病組為急性期清晨空腹采取)外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，－80℃冷凍保存。用DNA試劑盒(Promega公司)提取外周血基因組DNA，于－20℃保存備用。PCR擴增:根據NCBI公布rs113420705核苷酸序列用GENE RUNNER軟件設計引物:上游引物5'-CGGAAGCAGTGCAGACGC-3'，下游引物 5'-CACTCCGCCTTCCAGACC-3'，并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系為50μL，含基因組DNA 4μL，MasterMix 22μL，ddH2O 22 μL，上下游引物各 1 μL。采用美國ABI公司2720型PCR擴增儀，反應條件:預變性95℃ 10 min，變性94℃ 30 s，退火64℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，變性、退火、延伸共30個循環，終末延伸72℃ 5 min。取5μL PCR產物，2．0%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下鑒定產物。取182 bp處擴增條帶陽性標本的PCR產物30μL，委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。應用Chromas軟件分析所獲測序結果。利用NCBI網站在線blast對所獲序列進行對比分析。

1．2．2 統計學方法 采用SPSS17．0統計學軟件，計數資料以例(%)表示，組間比較及組間人群基因分布Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗采用χ2檢驗，檢驗水準雙側α=0．05。各組間CASP3 rs113420705位點等位基因型頻率、基因型頻率及各基因型的關聯強度采用比值比(OR)表示，采用95%置信區間(CI)。

2 結果

2．1 PCR擴增結果 PCR產物電泳目的條帶為182 bp，以50 bp Marker為核酸分子量參照標準，擴增產物目標條帶在150～200 bp。見圖1。

圖1 PCR產物電泳圖

2．2 CASP3 rs113420705基因型分布 參照NCBI網站SNP rs1801274，利用該網站在線blast對所獲序列進行對比分析發現，所有研究對象檢測到SNP rs113420705，基因型為 GG、GA及 AA 3種，見插頁Ⅱ圖2。其中病例組GG基因型12例，GA基因型19例，AA基因型9例;對照組GG基因型19例，GA基因型9例，AA基因型2例。川崎病組和對照組基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P均 ＞0．05)，表明各基因型頻率已達遺傳平衡，具有良好的群體代表性。

2．3 CASP3 rs113420705位點測序結果分析

2．3．1 川崎病組與對照組等位基因頻率及基因型頻率的分布 川崎病組A等位基因頻率為37(46．3%)，對照組為13(21．7%)，差異有統計學意義(χ2=9．03，P ＜ 0．05;OR=3．11，95%CI:1．46 ～6．62)。A等位基因的OR值＞1，故A等位基因使川崎病發生的危險度增加。川崎病組AA基因型頻率為9(22．5%)，GA 基因型為 19(47．5%)，GG 基因型為 12(30．0%)，對照組分別為 2(6．7%)、9(30%)、19(63．3%)，基因型分布在兩組間差異顯著(χ2=7．72，P ＜0．05)。攜帶 A 等位基因的 AA、GA 基因型的OR值均＞1(2．11、4．06)，表明攜帶A等位基因的AA、GA基因型使川崎病發生的危險度增加。

2．3．2 冠狀動脈損害組和無損害組等位基因及基因型分布 冠狀動脈損害組A等位基因頻率為37(46．3%)，冠狀動脈無損害組A等位基因頻率為13(21．7%)，A等位基因頻率在兩組間差異無統計學意義(χ2=2．21，P ＞0．05，OR=1．97，95%CI:0．80～4．84)，而A等位基因的 OR值 ＞1，可見 A等位基因在一定程度上是川崎病患者冠狀動脈損害發生的危險因素。冠狀動脈損害組AA、GA、GG基因型頻率分別為 6(35．3%)、7(41．2%)、4(23．5%)，冠狀動脈無損害組分別為 3(13．0%)、12(52．2%)、8(34．8%)，攜帶A等位基因的AA、GA基因型頻率在兩組間無顯著差異 (χ2=0．59，P ＞0．05)。其中AA 基因型 OR=3．64，95%CI:0．76 ～17．46;GA 基因型 OR=0．64，95%CI:0．18 ～2．28。可見攜帶 A等位基因的基因型在一定程度上使川崎病發生冠狀動脈損害發生的危險因素增加。

3 討論

川崎病作為一種自身免疫性血管炎，其發病機制仍尚不清楚。一個可能原因為自身免疫降低，多見于感染侵襲后細胞凋亡過程發展有缺陷的兒童［10］。因此，通過鑒定與細胞凋亡機制相關的遺傳因素，將大大促進明確川崎病的病因。細胞凋亡是機體正常細胞在基因調控下的程序性死亡。T細胞異常活化是川崎病免疫損傷的關鍵步驟，在川崎病急性期外周血活化 T 細胞異常增高是由凋亡延遲所致［10，11］，而Caspase-3在T細胞凋亡中的作用至關重要［12］。

本研究應用PCR和直接測序方法，檢測了40例川崎病患兒和30例健康兒童CASP3基因rs113420705，顯示CASP3基因rs113420705突變位點為3種基因型 GG、GA、AA，突變基因型分別為GA、AA。本研究結果顯示，CASP3基因rs113420705位點A等位基因可以導致川崎病發生的危險度增加(OR=3．11)。本組40例川崎病患兒中28例含有A等位基因，30例健康兒童中僅11例含有A等位基因，A等位基因頻率在川崎病組與對照組間比較具有顯著差異，含有A等位基因的兒童易發生川崎病，與Onouchi等［6］在日本人群和歐裔美國人群中得出的結論一致。

rs113420705位點位于CASP3基因5'非編碼區區，其與周圍堿基構成的GGAA序列類似于轉錄因子—活化T細胞核因子(NFAT)的結合位點，它能開啟IL-2和其他細胞因子的轉錄。CASP3基因rs113420705位點為G等位基因時，其與周圍區域可以與NFAT結合，并作為T細胞受體信號激活T細胞的增強因素，CASP3表達上調，而在川崎病患兒中，該位點 G變為 A，其增強作用減弱，影響NFAT的結合，CASP3基因的表達明顯下降，使T細胞的凋亡受限，活化T細胞相應增多，啟動了川崎病的發病［6］。當CASP3表達下降時，NFATc2裂解減少［13］，致使多種炎性因子增加，也促進了川崎病的發生。這些遺傳變異又導致了炎性反應過程中T細胞增殖增加及凋亡下降，在川崎病急性期、亞急性期，外周血活化T細胞異常增高［14］，又為川崎病的發生提供了條件。

本研究還顯示，CASP3基因rs113420705位點A等位基因導致川崎病發生冠狀動脈損害的危險度增加(OR=1．97)，然而兩組差異并不顯著(χ2=2．21，P ＞0．05)，與 Onouchi等［6］在日本人群和歐裔美國人群中所得結論一致。

此外，Kuo等［8］在臺灣人群中發現，CASP3基因rs113420705位點為A等位基因的川崎病患兒易發生冠狀動脈瘤。本研究中發生冠狀動脈瘤者例數偏少，未能進行相關性驗證。Onouchi等研究顯示，A等位基因頻率在靜脈用人丙種免疫球蛋白(IVIG)不敏感患者中顯著增高［7］。本研究中所有患兒對IVIG敏感，未能進行CASP3基因與IVIG敏感性的相關比較，有待增加樣本量后進一步研究。

總之，川崎病是一種多原因引起的免疫性疾病，研究表明其與基因多態性相關，然至目前為止，并未形成定論。本研究表明，CASP3基因多態性與中國漢族兒童川崎病易感性相關，與冠狀動脈損害相關性并不明顯，仍有待于研究者在樣本量、人群等方面進行一步的綜合分析。

［1］Newburger JW，Takahashi M，Gerber MA，et al．Diagnosis，treatment，and long-term management of Kawasaki disease:a statement for health professionals from the Committee on Rheumatic Fever，Endocarditis，and Kawasaki Disease，Council on Cardiovascular Disease in the Young，American Heart Association［J］．Pediatrics，2004，114(6):1708-1733．

［2］JCSJoint Working Group．Guidelines for Diagnosis and Management of Cardiovascular Sequelae in Kawasaki Disease(JCS 2008)［J］．Circ J，2010，74(9):1989-2020．

［3］Takahashi K，Oharaseki T，Yokouchi Y．Pathogenesis of Kawasaki disease［J］．Clin Exp Immunol，2011，164(Suppl 1):20-22．

［4］Sonobe T．A summary of the epidemiologic surveys on Kawasaki disease conducted over 30 years［J］．JMAJ，2005，48(10):30-33．

［5］Onouchi Y，Tamari M，Takahashi，A，et al．A genomewide linkage analysis of Kawasaki disease:evidence for linkage to chromosome12［J］．J Hum Genet，2007，52(2):179-190．

［6］Onouchi Y，Ozaki K，Buns JC，et al．Common variants in CASP3 confer susceptibility to Kawasaki disease［J］．JHum Genet，2010，19(14):2898-2906．

［7］Onouchi Y，Suzuki Y，Suzuki H，et al．ITPKC and CASP3 polymorphisms and risks for IVIG unresponsiveness and coronary artery lesion formation in Kawasaki disease［J］．Pharmacogenomics J，2013，13(1):52-59．

［8］Kuo HC，Yu HR，Juo SH，et al．CASP3 gene single-nucleotide polymorphism(rs72689236)and Kawasaki disease in Taiwanese children［J］．J Hum Genet，2011，56(2):161-165．

［9］楊軍，李成榮，李永柏，等．腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-10基因啟動子區多態性與川崎病的相關性研究［J］．中華兒科雜志，2003，41(8):598-602．

［10］Kim HY，Lee HG，Kim DS．Apoptosis of peripheral blood mononuclear cells in Kawasaki disease［J］．Clin Exp Immunol，2000，27(3):801-806．

［11］Sanghera DK，Manzi S，Bontempo F，et al．Role of an intronic polymorphism in the PDCD1 gene with the risk of sporadic systemic lupus erythematosus and the occurrence of antiphospholipid antibodies［J］．JHum Genet，2004，115(5):393-398．

［12］朱曉東，林庚金，錢立平，等．凋亡通路及其調控研究進展［J］．國外醫學:生理病理科學與臨床分冊，2002，22(3):248-251．

［13］Wenfang WU，Misra RS，Russell JQ，et al．Proteolytic regulation of nuclear factor of activated T(NFAT)c2 cells and NFATactivity by caspase-3［J］．JBiol Chem，2006，281(16):10682-10690．

［14］Sohn SY，Song YW，Yeo YK，et al．Alteration of CD+4CD+25Foxp3+T cell level in Kawasaki diseaseKorean［J］．JPediatr，2011，54(4):157-162．