空瓶刺激心理應激法建立大鼠血管內皮損傷模型的評價

梁 斌，黎 靜，楊曉梅，謝 露

(廣西醫科大學生理學教研室，南寧530021)

血管內皮細胞(VEC)在維持血管正常功能方面發揮重要作用，它不僅是血液與組織液之間的屏障，而且可分泌多種活性物質來調節血管壁張力以及血管平滑肌的增殖，如內皮素-1(ET-1)可以使血管強烈收縮及促進細胞分裂，前列環素(PGI2)和一氧化氮(NO)使血管舒張等［1］。VEC受損或功能障礙是血管疾病發病機制中的一個重要因素，與心血管疾病臨床危險事件的發生密切相關［2］。在VEC損傷因素中，除高血壓、高血糖、高同型半胱氨酸、血脂紊亂、炎癥刺激外，心理應激也是一個不容忽視的危險因素。各式各樣的心理應激刺激，如與情緒有關的焦慮、抑郁，與環境有關的空氣污染、噪聲，與行為有關的工作、生活壓力等，都可構成各自獨立的心血管系統危險因素［3］。心理應激時交感神經活動增強，機體釋放腎上腺素(Adr)、皮質醇(COR)、ET、血栓素B2(TXB2)及Adr的代謝產物如過氧化氫(H2O2)、甲醛(FA)、甲胺(MA)等物質增多，或引起血管舒縮因子失調，或直接損害VEC，進而引起血管病變［4］。本課題組前期研究發現，憤怒心理刺激模型可以損傷VEC，改變其形態并影響其功能。2011年5月1～22日，我們擬制作空瓶刺激心理應激模型大鼠，通過觀察其行為學改變，檢測應激激素及其代謝產物、VEC活性物及其超微結構，并進行評價，為心理應激與VEC損傷關系的研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1．1 材料 實驗動物:健康成年雄性SD大鼠，10～15周齡，體質量200～250 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號為 SCXK桂2009-0002。實驗設備:臺式低速離心機(湘儀離心機儀器有限公司)，iMARK型全自動酶標儀(美國Bio Rad公司)，紫外光—可見光分光光度計(上海精密科學儀器公司)，自動恒溫水浴箱(南京環科試驗設備有限公司)，-80℃低溫冰箱(日本三洋)，H-7650透射式電子顯微鏡(日本日立公司產品)，自制曠場箱，LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本島津產品)，SUPEL COSILTM LC-PAH色譜分離柱(日本島津產品)，超純水機(Mllipoer)，旋渦混勻器(德國IKA)，進樣針(Hmailton)。試劑:Adr試劑盒(武漢華美生物公司)，ET試劑盒(北方放射免疫生物技術公司)，6-酮-前列環素 F1α(6-Keto-PGF1α)試劑盒(北方放射免疫生物技術公司)，TXB2試劑盒(北方放射免疫生物技術公司);COR試劑盒(北方生物技術研究所)，NO試劑盒(cayman chemical company)，過氧化氫(H2O2)檢測試劑盒(南京建成生物有限公司產品);氨芐西林(Sigma產品);分析純三氯乙酸(TCA);MA(Sigma產品)，丹磺酰氯(Sigma產品)，37%FA水溶液(Sigma產品)，乙腈(美國Tedia產品)，甲醇(美國天地產品)，Milli2Q超純水，生理鹽水(湖南金健藥業有限責任公司)。

1．2 方法

1．2．1 分組與造模 將16只雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組各8只，兩組第1周每天早晚9點定時喂水10 min;第8～21天，對照組(群居飼養)早晚9點依然定時飲水10 min，模型組(孤獨飼養)早晚9點按隨機表給予空瓶刺激或喂水10 min，兩組均按體質量腹腔注射生理鹽水(200 g/mL)2次/d。

1．2．2 大鼠行為學觀察 采用自制曠場箱觀察大鼠行為學變化。曠場箱為高50 cm，長、寬均為100 cm;其周壁、底面為黑色，底面用黃線劃分為面積相等的25格(20 cm ×20 cm)。將大鼠置于曠場箱底面的中心方格內并開始計時，采用單盲法觀察并記錄大鼠在3 min內的行為。動物穿越底面的格數(四爪均進入的方格)記錄為水平活動得分，跨越一格計1分;后肢直立次數(兩個前爪騰空或攀附箱壁)為垂直活動得分，直立1次計1分。水平得分與垂直得分之和為總分。

1．2．3 血漿相關因子檢測 取各組大鼠血漿，用ELISA法檢測 Adr，放射免疫法檢測 ET、6-Keto-PGF1α、TXB2、COR，硝酸還原酶法檢測 NO，化學比色法檢測H2O2，高效液相色譜法測MA、FA。

1．2．4 統計學方法 采用SPSS13．0統計軟件。結果以±s表示，組間差異比較采用單因素方差分析。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 兩組大鼠曠場實驗評分比較 模型組垂直得分(11．33 ±4．97)分、水平得分(57．43 ±7．64)分、總分(68．77±10．94)分，對照分別為(5．83±1．47)、(42．50 ±8．41)、(48．33 ± 9．58)分;兩組比較，P 均 ＜0．05。

2．2 兩組大鼠血漿COR、Adr水平比較 見表1。

表1 兩組大鼠血漿COR、Adr比較(n=8±s)

表1 兩組大鼠血漿COR、Adr比較(n=8±s)

注:與對照組比較，*P ＜0．05

組別 COR(ng/mL) Adr(pg/mL)模型組 21．47 ±3．65* 9．37 ±1．69*對照組14．67 ±2．98 2．73 ±1．34

2．3 兩組大鼠血漿6-Keto-PGF1α、TXB2水平比較見表2。

表2 兩組大鼠血漿6-Keto-PGF1α、TXB2水平比較(n=8，± s)

表2 兩組大鼠血漿6-Keto-PGF1α、TXB2水平比較(n=8，± s)

注:與對照組比較，*P ＜0．05

組別6-Keto-PGF1α(pg/mL)TXB2(pg/mL)6-Keto-PGF1α/TXB2模型組 53．19 ±11．23* 515．07 ±68．66 0．10 ±0．02*對照組95．41 ±30．38 472．61 ±48．73 0．19 ±0．07

2．4 兩組大鼠血漿NO、ET水平比較 見表3。

表3 兩組大鼠血漿NO、ET水平比較(n=8ˉ±s)

表3 兩組大鼠血漿NO、ET水平比較(n=8ˉ±s)

注:與對照組比較，*P ＜0．05

組別 NO(mmol/mL) ET(pg/mL)NO/ET模型組 19．13 ±2．95* 28．89 ±2．53* 0．66 ±0．09*對照組25．00 ±4．04 24．73 ±6．35 1．02 ±0．18

2．5 兩組大鼠血漿 MA、FA、H2O2水平比較 見表4。

表4 兩組大鼠血漿MA、FA、H 2O2水平比較(n=8，±s)

表4 兩組大鼠血漿MA、FA、H 2O2水平比較(n=8，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0．05

組別 MA(ng/mL) FA(ng/mL) H2O2(mmol/L)模型組 37．35 ±10．14* 7．34 ±2．37* 57．20 ±10．28*對照組22．78 ± 4．24 4．72 ±1．20 23．92 ± 8．04

2．6 兩組大鼠主動脈VEC透射電鏡結果比較 對照組VEC線粒體結構完整，嵴清晰、排列緊密;模型組VEC線粒體腫脹、內有空泡，嵴結構疏松。見圖1。

圖1 兩組大鼠主動脈VEC透射電鏡結果(×5 000)

3 討論

應激是指施加于個體的、引起個體發生反應的軀體或心理的壓力，是個體在覺察需求與滿足需求的能力不平衡時傾向于通過整體心理和生理反應表現出來的多因素作用的適應過程［5］。心理應激作為應激的一個重要部分，它與疾病之間亦有著緊密聯系，無論是急性或慢性心理應激都顯著影響疾病的發生、發展及預后，如腫瘤、高血壓、中風等［6］。因此，成功構建一個心理應激動物模型，用以研究人們對應激概念的認識及對應激相關性疾病的研究尤為重要。

應激的反應主要有情緒反應、行為反應、認知反應和心理防御反應等。焦慮、憤怒、恐懼及抑郁是應激環境下的主要情緒反應，由于應激源、情境因素和機體特點的不同而不同。應激下的行為反應與情緒反應一樣，因應激源及環境因素等的不同而不同。攻擊是個體受到挫折之后常見的反應［7］。曠場實驗是研究大鼠在新環境中的探究行為及情緒的經典方法，可有效評價動物對新異環境的興奮性、適應性、探究、緊張、記憶等多種行為［8］，可用來測試動物中樞神經系統的興奮或抑郁狀態［9］。實驗中，動物的水平得分反映動物的興奮性，垂直得分則主要反映動物對周圍環境的不確定性和探究趨勢［8］。本實驗結果顯示，模型組大鼠的水平得分和垂直得分均明顯高于對照組，表明空瓶刺激后大鼠興奮性、敏感性增強，探究活動增多，此結果與其他報道相似［10］，且給予空瓶情緒刺激的模型組出現了在陌生環境中的自主活動和探究行為增多的表現，說明在應激后大鼠產生了情緒應激反應。

急性或長期慢性心理刺激可以損傷VEC，這是導致心腦血管疾病的一個重要因素［11］。應激反應由于常反復啟動內皮損傷，引起血管舒縮因子分泌失衡，可最終導致心血管的病變［4］。VEC釋放血管舒張因子NO、PGI2，血管收縮因子ET-1、TXA2等調節血管的舒縮功能，從而維持基礎張力的穩定［6］。Wallace等［12］研究證實，VEC損傷后，ET合成增多、NO合成和釋放減少，導致血管張力調節紊亂，內皮依賴性舒張功能下降，血管壁結構改變，進而引起血壓升高。VEC合成的另一對調節血管張力的細胞因子是TXA2和PGI2，TXA2和PGI2是作用相反的兩種前列腺素。TXA2由血小板釋放，可使血小板的聚集加重，及引起血管收縮;PGI2則相反，可防止血小板聚集及血管收縮，是一種血管擴張劑［6］。二者在血液中不穩定，檢測其代謝產物TXB2和6-Keto-PGF1α能較好地反映體內兩者的水平。本研究顯示，模型組血漿 NO、6-Keto-PGF1α水平顯著降低，ET水平顯著升高，并且 NO/ET、6-Keto-PGF1α/TXB2值均降低，說明心理應激造成的內皮損傷導致了血管的舒縮因子釋放失衡。

Adr是腎上腺髓質分泌的主要激素，當機體受到強烈刺激的時候，如興奮、恐懼、緊張等，機體出現以交感神經興奮、兒茶酚胺分泌增加及下丘腦—垂體—腎上腺皮質增多為主的一些列神經內分泌活動，以適應或對抗刺激對機體的傷害。這樣的反應對機體既有防御意義又有病理意義［13］。腎上腺髓質適量的分泌Adr，可使機體呼吸加快，心跳與血液流動加速，瞳孔放大，為身體活動提供更多能量，使反應更加快速。但是，激烈的應激使垂體—腎上腺皮質系統和交感—腎上腺髓質系統持續興奮，使血液中Adr的分泌增加并維持在較高水平，其強烈的縮血管作用可對血管的功能、結構造成損傷［13］。同時，在應激條件下，COR水平迅速升高，是應激反應中最重要的一種內分泌活動，其水平和持續時間與刺激強度有關，對機體抗損傷起重要作用，故COR的水平可作為反映應激強度的指標。有研究表明，在大量燒傷患者的休克期，血漿COR水平可以達到正常的3倍，經治療后有所下降，但仍然高于正常［6］。在本研究中，空瓶刺激心理應激模型組血漿Adr、COR水平比對照組明顯增高，這進一步說明大鼠在受到空瓶應激后產生了情緒反應及神經內分泌反應。

體內 Adr可在相關酶的作用下，脫氨生成H2O2、MA、FA等毒性代謝物，它們的生成如高于機體清除率，毒性物質進入血液循環的時間延長，能夠損害 VEC 組織結構和功能［4．6］。臨床研究顯示，患有動脈粥樣硬化、糖尿病血管病變者，其血漿FA濃度增高，同時伴有繼發性內皮功能不全。FA和H2O2還可引起蛋白交聯、氧化應激，進而損傷內皮［14］。本實驗研究結果發現，模型組血漿中H2O2、MA、FA高于對照組。結合射電鏡觀察VEC的超微結構進一步發現，電鏡下對照組VEC的線粒體膜完整，嵴清晰，基底膜下無水腫，而模型組VEC的線粒體嵴模糊，部分線粒體出現空泡，基底膜下基質增多，出現水腫。有研究結果表明，細胞對應激原的反應與應激原的性質、作用強度和細胞種類有關，如果刺激輕微以及時間短，則細胞可消除侵害，恢復到損傷前的狀態。如果刺激不致達到致死量，則細胞會通過改變其結構和功能的適應性做出改變，受累細胞出現可逆性損傷，表現出代謝、功能及形態異常等變化。在線粒體，應激是引起其通透性轉運孔開放，這可造成細胞內膜的屏障功能破壞，使得小于1．5 kDa的任何分子可以自由穿過線粒體膜，而蛋白質不能通過，因而導致其膠體滲透壓改變，造成線粒體腫脹。更嚴重的損傷則會是線粒體內膜破壞，最終引起細胞的死亡［15］。透射電鏡的結果，也進一步說明空瓶刺激心理應激引起了大鼠VEC損傷。

綜上所述，從血漿COR、NO水平變化以及VEC分泌的舒縮因子及掃描電鏡觀察可知，空瓶刺激心理應激導致了大鼠VEC功能和結構的損傷。該模型操作方便、周期短，是較理想的心理應激性內皮損傷動物模型，能夠為心理應激引發心血管疾病的發生、發展研究提供一種較好的模型。

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