外周血單核細胞TLR2、TLR4與急性胰腺炎肺損傷的關系

蔣海弦，李天舒，顧國寶，周鳴清，陸仁達

（上海閘北區(qū)中心醫(yī)院，上海200070）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是胰酶引起的一種化學炎癥反應性疾病，其出血壞死型（acute necrotizing pancreatitis，ANP）病情兇險，預后差，病死率高達50%左右。急性胰腺炎相關性肺損傷（acute pancreatitis－associated lung injury，APALI）是AP最常見的并發(fā)癥，是患者早期死亡的重要原因.炎癥介質的互相激活和級聯(lián)反應是APALI的重要發(fā)生機制之一。多種炎性因子參與了急性胰腺炎肺損傷的發(fā)生，如IL－6，TNF－α，p物質等，其中涉及多種細胞如內皮細胞、單核細胞等［1］。最近研究發(fā)現(xiàn)［2］，toll樣受體（toll－like receptor，TLR）參與了急性胰腺炎并發(fā)肺損傷的過程，敲除TLR4基因的小鼠，急性胰腺炎炎癥程度減輕且肺損傷明顯減少。但TLR是否與急性胰腺炎肺損傷的發(fā)生相關，仍缺乏臨床資料。本研究擬回顧分析本院收治的急性胰腺炎患者外周血單核細胞TLR2、4的表達與急性胰腺炎合并肺損傷的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2010年01月－2011年06月我科收治的急性胰腺炎患者30例，其中男性16例，女性14例；年齡21－62歲（平均45.9±12.2歲）；并選擇10例體檢健康人群作為對照，其中男女性各5例，年齡35－64歲（平均51.1±12.6歲）。

1.2診斷標準

急性胰腺炎診斷標準：符合急性胰腺炎的臨床征象（腹痛、腹脹、惡心嘔吐、腹部壓痛等）；入院時血淀粉酶大于正常上限3倍或以上；有或無影像學診斷（B超或C T）者，無論病情輕重均納入（參照1992年亞特蘭大會議標準［3］或1996年中華醫(yī)學會外科學會胰腺學組標準［4］。

1.3外周血單核細胞TLR mRNA表達檢測

空腹肘靜脈全血5ml，參考文獻報道方法［5］，采用Ficoll－Hypaque密度分離法分離外周血單核細胞，Trizol抽提總RNA，逆轉錄成cDNA（Promega公司），等量cDNA依照PCR Kit（Invitrogen公司）提供的步驟進行PCR。參考文獻，其引物序列如下：TLR2（6）上游引物CCCAGGAAAGCTCCCAGCAG，下 游 引 物 GGAACCTAGGACTTTATCGCAGCTC；TLR4（7）上游引物CATTCAAGACCAAGCCTTTCAG，下 游 引 物 CCAGGTTTTGAAGGCAAGTTTT；GAPDH（7）上游引物 TGCACCACCAACTGCTTAG，下 游 引 物GGATGC AGGGATGATGTTC。反應條件為94℃預變性7min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共33個循環(huán)。PCR產物加樣于2%瓊脂糖凝膠，電泳，紫外燈下觀察，凝膠分析系統(tǒng)拍照。Quantity one軟件分析，目的基因／GAPDH值為相對表達量。按TLR2與TLR4mRNA相對表達量，將急性胰腺炎患者分為TLR2、4高表達組（≥2倍健康組）與低表達組（＜2倍健康組）。

1.4統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包處理，其中不同組別間計量資料比較采用t檢驗；不同分組中急性胰腺炎肺損傷的比較，采用卡方檢驗，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

與健康組相比較，急性胰腺炎患者外周單核細胞TLR2與TLR4mRNA表達明顯升高（P＜0.01）。（圖1）

圖1 急性胰腺炎TLR2與TLR4蛋白表達

按TLR2mRNA表達水平將急性胰腺炎患者分為兩組：TLR2高表達組（≥2倍健康組）與TLR2低表達組（＜2倍健康組），TLR2的表達與急性胰腺炎并發(fā)肺損傷無明顯相關（P＝0.105），不同TLR2mRNA表達組的急性胰腺炎患者發(fā)生肺損傷的OR值3.677倍，但無統(tǒng)計學意義（95%CI：0.733－18.332）（表1）。

表1 不同外周單核細胞TLR2表達急性胰腺炎肺損傷比較

按TLR4mRNA表達水平將急性胰腺炎患者分為兩組：TLR4高表達組（≥2倍健康組）與TLR4低表達組（＜2倍健康組），TLR4的表達與急性胰腺炎并發(fā)肺損傷明顯相關（P＜0.01），不同TLR4mRNA表達組的急性胰腺炎患者發(fā)生肺損傷的 OR 值為 18，有統(tǒng)計學意義 （95%CI：2.756－117.544）。

表2 不同外周單核細胞TLR4表達急性胰腺炎肺損傷比較

3 討論

急性胰腺炎（AP）的發(fā)病機制復雜、病程兇險，病死率極高，在其胰外損傷中以急性肺損傷（ALI）最為突出，甚至可繼發(fā)急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。如何能早期發(fā)現(xiàn)或預測急性胰腺炎并發(fā)肺損傷的患者，爭取早期的干預，對于減少急性胰腺炎病死率有著重要的臨床意義。

研究發(fā)現(xiàn)，AP中常伴發(fā)腸源性內毒素血癥，脂多糖（LPS）濃度常常增高［8］。TLR家族是LPS的受體，主要分布在單核／巨噬細胞表面的TLR4、TLR2對LPS炎癥信號向胞內轉導中起主要作用［9］。TLR2、TLR4與LPS結合后，通過激活單核細胞內的NF－κb信號通路，促進炎性因子如IL－1、TNF等的分泌，從而在急性胰腺炎發(fā)生中起著重要的作用［10］。本研究中，我們檢測急性胰腺炎的單核細胞TLR2與TLR4的表達，發(fā)現(xiàn)TLR2及TLR4mRNA表達水平明顯增高，這與前期的研究結果一致。

多項研究表明，AP肺損傷與肺組織內有大量炎性細胞浸潤，包括中性粒細胞及單核細胞，單核／巨噬細胞在AP并發(fā)肺損傷的發(fā)生中起著重要作用［11］。AP發(fā)生時，肺部的炎癥反應會促使LPS的大量增多，通過TLR受體激活肺部聚集的單核／巨噬細胞，導致肺血管內皮功能的損傷，并抑制Fas基因的表達，減少炎性細胞的凋亡［12，13］，這提示 LPSTLR軸在單核細胞的激活可能是肺損傷發(fā)生的關鍵機制。本研究中，我們通過檢測AP并發(fā)肺損傷患者單核細胞的LPS主要受體TLR2與TLR4表達，并將其分為（≥2倍健康組）與TLR2低表達組（＜2倍健康組），發(fā)現(xiàn)TLR2的表達與AP肺損傷發(fā)生之間無明顯相關；而TLR4的表達與AP并發(fā)肺損傷明顯相關，高表達TLR4的患者AP并發(fā)肺損傷風險是低表達的18倍，這提示AP單核細胞TLR4的表達高低是AP并發(fā)肺損傷的危險因素。前期研究發(fā)現(xiàn)，盡管TLR2與TLR4均是LPS的受體，但TLR4主要介導革蘭氏陰性菌引起的炎性反應，是LPS在單核細胞效應的主要介導者［9，14］，這可能是TLR4而不是TLR2的在單核細胞的表達是AP并發(fā)肺損傷的危險因素。

值得注意的是，本研究雖然提示TLR4的單核細胞的表達是AP并發(fā)肺損傷的危險因素，但由于本研究樣本量偏小，這可能會造成研究結果的偏倚；另外，由于研究條件的限制，本研究中沒有排除患者基礎的炎癥及免疫狀態(tài)對單核細胞TLR4預先激活的影響，這些均需要后續(xù)深入研究。盡管如此，本研究通過病例對照發(fā)現(xiàn)TLR4在單核細胞的表達是AP并發(fā)肺損傷的一個危險因素，為AP并發(fā)肺損傷的高危人群篩選提供了一個潛在的指標。

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