氫氣生理鹽水對大鼠肝缺血再灌注后氧化應激損傷的保護作用

駱助林，湯禮軍，汪 濤，羅 浩，黃 竹，王 華，田伏洲

肝臟的缺血再灌注損傷(ischemia－reperfusion injury，IRI)是肝臟外科重要的臨床病理生理過程，導致肝葉切除、肝移植術后器官功能障礙和衰竭的重要因素［1］。因此在肝臟外科中如何采取措施，減輕肝臟缺血再灌注損傷具有重要意義。最近發(fā)現氫氣能抑制炎癥相關的細胞因子、緩解炎癥發(fā)展，抑制氧化應激損傷，具有潛在的治療炎癥應激性疾病的作用［2］，我們推測氫氣生理鹽水(hydrogen-rich saline，HS)在肝臟缺血再灌注損傷過程中氧化應激損傷中也起著一定的作用，因此我們采用70%大鼠肝臟缺血再灌注模型，對氫氣生理鹽水在肝臟缺血再灌注損傷中的作用進行研究，報告如下。

材料與方法

1 實驗動物分組及處理

成年健康雄性清潔級Wistar大鼠32只，質量(200±50)g，第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院動物中心提供［動物合格證編號:SCXK(渝)20020002］。氫氣生理鹽水(0.6mM)由第二軍醫(yī)大學孫學軍教授提供［3］，儲存于密封的塑膠袋中 4°C 下保存，使用前經伽瑪射線消毒。將32只大鼠均分成4組(n=8):(1)假手術組(sham)，動物只接受開腹關腹手術;(2)肝缺血再灌注組(IR);(3)肝缺血再灌注+生理鹽水處理組(IR+NS);(4)肝缺血再灌注+氫氣生理鹽水處理組(IR+HS)。

2 動物模型制作

大鼠術前禁食12h，自由飲水，乙醚吸入麻醉。腹正中切口約2cm，用小血管夾夾閉左、中葉肝蒂，造成70%肝臟缺血動物模型［4］，保持肝右葉和尾狀葉血流通暢，45min后取下血管夾恢復肝臟血供后關腹。氫氣生理鹽水(0.6mM，6ml/kg，pH 7.4)或者生理鹽水(6ml/kg)在肝臟缺血同時經尾靜脈注射。假手術組僅開腹后游離肝臟周圍韌帶然后關腹。術后大鼠自然清醒并自由飲水。

3 檢測指標及方法

術后12h處死大鼠，統(tǒng)一取大鼠部分組織肝，用10%甲醛固定并常規(guī)制作石蠟病理切片，蘇木精-伊紅染色(HE)后由專門的病理學醫(yī)師進行病理觀察，剩下的肝組織0°C生理鹽水中冰浴保存。大鼠血清丙氨酸轉氨酶(AIR)和天冬氨酸轉氨酶(AST)水平采用全自動生化分析儀檢測，肝組織內SOD活性、GSH、MDA含量均采用檢測試劑盒(南京建成生物制品公司)并按說明書進行操作。SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)，GSH含量測定采用化學比色法，MDA含量的檢測采用硫代巴比妥酸(TBA)法。

4 統(tǒng)計學處理

結 果

1 肝組織病理學變化

鉗夾肝蒂后，肉眼觀察到被阻斷的肝葉明顯缺血發(fā)暗，肝臟表面可見淤積斑塊，開放后可見充血紅潤。各組肝組織病理變化見附圖。假手術組大鼠各時點肝臟組織結構清晰，無明顯炎癥細胞，肝細胞無變性壞死(圖1a)。IR組和IR+NS組大鼠術后12h可見肝竇內瘀血及部分肝細胞變性壞死，匯管區(qū)大量炎癥細胞聚集，以中性粒細胞為主，肝臟組織結構疏松，部分組織結構不完整(圖1b、C);IR+HS組大鼠術后12h細胞腫脹變性，點狀肝細胞壞死，肝臟組織內炎癥細胞浸潤，以中性粒細胞為主，肝臟組織結構基本完整(圖1d)。

圖1 各組術后12h肝臟組織病理變化(HE ×400)

2 術后12h血清ALT、AST的檢測

IR組、IR+NS組與IR+HS組動物于造模術后12h血清ALT、AST明顯升高;與IR+NS組相比較，IR+HS組術后12h血清 ALT、AST升高較少(P ＜0.05)(表 1)。

表1 術后12h血清ALT、AST(IU/L，±s，n=8)

表1 術后12h血清ALT、AST(IU/L，±s，n=8)

與 IR+NS組相比較:△P ＜0.05

分組ALT AST sham 29.88 ±4.85 94.38 ±14.27 IR 264.13 ±24.29 427.38 ±16.81 IR+NS 227.63 ±1.41 420.54 ±35.18 IR+HS 108.13 ±28.06△ 265.55 ±27.68△

3 術后12h肝組織內 SOD活性和GSH、MDA含量的檢測

IR組、IR+NS組與IR+HS組動物于造模術后12h肝組織內MDA含量明顯升高，SOD活性和GSH含量下降;與IR+NS組相比較，IR+HS組術后肝組織內MDA含量升高較少(P＜0.05)，SOD活性和GSH含量下降程度也較低(P＜0.05)(表2)。

表2 術后12h肝組織內SOD活性和GSH、MDA含量的檢測(±s，n=8)

表2 術后12h肝組織內SOD活性和GSH、MDA含量的檢測(±s，n=8)

與 IR+NS組相比較:△P ＜0.05

分組 SOD(U/mg)MDA(pmol/mg)GSH(pmol/mg)sham 38.2 ±4.9 23.5 ±7.1 2675 ±157 IR 12.9 ±2.2 87.4 ±13.6 1234 ±113 IR+NS 12.4 ±3.6 86.7 ±26.8 1287 ±175 IR+HS 21.6 ±2.5△ 38.4 ±11.5△ 1971±96△

討 論

肝臟IRI的確切機制目前仍不清楚，氧自由基的大量形成和脂質過氧化的增加是細胞損傷的主要病理過程之一，氧化應激損傷在局部及全身炎性損傷中起重要作用［5］。器官、組織IRI時發(fā)生急性炎癥反應，大量的炎癥細胞活化并分泌大量的炎癥遞質，引起局部及全身的器官損傷［6－7］。再灌注早期中性粒細胞即開始向損傷部位浸潤，通過釋放ROS以及多種蛋白水解酶(蛋白酶、彈性蛋白酶以及MPO 等)加重細胞損傷［8－9］。Glantzounis等［10］發(fā)現活性氧(ROS)在肝臟氫氣生理鹽水中起非常重要的作用。當氧化應激發(fā)生時，ROS的產生與清除之間的平衡將會被打破，導致抗氧化系統(tǒng)的衰竭或者氧化物大量產生。對于肝臟缺血再灌注進行某些處理，如缺血預處理、熱應激預處理、藥物處理等，可以降低中性粒細胞的浸潤，提高細胞對應激原的耐受性，阻止 ROS，減輕肝臟損傷程度［11］。

氫氣是質量最輕的小分子氣體，很容易擴散并輕易地穿過細胞膜。最近Ohsawa等［2］研究發(fā)現氫氣的抗氧化特性，在臨床治療氧化應激損傷方面有廣闊的應用前景，為氫氣的臨床應用提供了方向。將氫氣溶解于細胞培養(yǎng)基中，則能防止細胞在氧化損傷后出現的線粒體去極化、AIR缺乏、DNA氧化、脂質過氧化反應和細胞的壞死、凋亡，增強細胞活力。因此我們推測HS處理后，在缺血再灌注過程中也能緩解氧化應激損傷，減輕肝缺血再灌注時的局部和全身損害。

本研究采用70%大鼠肝臟缺血再灌注模型，術中經HS經尾靜脈注射，術后通過病理評分顯示與IR+NS組相比較，IR+HS組病理損傷明顯較輕，說明HS處理能明確減輕IR病理損傷。我們觀察到再灌注后12h，肝臟組織內有大量中性粒細胞浸潤，而HS明顯降低了肝臟組織內中性粒細胞浸潤。SOD和GSH對機體的氧化與抗氧化的平衡起著關鍵作用，能加速清體內除自由基和過氧化物，降低脂質過氧化物的生成，自由基和過氧化物對細胞和組織的損傷。MDA是細胞膜的重要成分－非飽和脂質過氧化反應的終產物，組織內MDA含量是體內氧化應激反應水平及程度的敏感指標［12］。與IR+NS組相比較，IR+HS組術后肝組織內MDA含量升高較少(P＜0.05)，SOD活性和GSH含量下降程度也較低(P＜0.05)，提示HS處理后的IR大鼠明顯的改善了氧化應激的損傷。本研究證實，HS能夠通過抑制肝缺血再灌注后的氧化應激反應，減輕肝IRI，但其具體過程和機制有待進一步研究。

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