叢枝菌根真菌孢子最適消毒方法及最佳培養基的研究

趙臘梅，刁亞楠，金海如

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江 金華 321004）

菌根是自然界中一種普遍的植物共生現象，它是土壤中的菌根真菌菌絲與高等植物營養根系形成的一種聯合體。由于部分真菌不在根內產生泡囊，但都形成叢枝，故簡稱叢枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM）。叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhiza fungi，AMF）就是這樣一類內生菌根真菌，它能與80%的陸地植物建立共生關系[1-2]，是迄今為止發現的所有類型菌根真菌中種類最全、數量最多的一類真菌。由于AMF屬于專性共生真菌，目前仍未能實現離體培養，只能將其接種在活體根系上或是與其寄主根系一起培養，常用的培養方法有盆栽法和離體雙重培養法。盆栽法的培養周期長、培養量大，又不便運輸，已較少使用[3]；而離體雙重培養法是目前國際上研究菌根真菌侵染機理、共生雙方物質和信息交換機制的主要方法[4]，對AMF生理生化研究以及菌劑的生產均有較大的貢獻。

離體條件下真菌孢子的萌發受多種因素的影響，例如消毒處理、培養基成分、pH酸堿度、重金屬含量、糖含量、孢子密度、孢子自身分泌的抑制物等[5]。而探究AMF孢子的最佳表面消毒處理是實現離體雙重培養的前提。因此，試驗從滅菌方法和培養基兩個方面來優化AMF孢子的萌發最優條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種 根內球囊霉菌（Glomus intraradices），由北京農林科學院植物營養與資源研究所“叢枝菌根真菌種質資源庫BGC AH01”提供。

1.1.2 培養基 （A）0.8%瓊脂培養基：準確稱取0.80 g瓊脂溶解于1 00 mL蒸餾水中，pH 6.5，120℃滅菌25 min。（B）0.8%瓊脂蔗糖培養基：稱取0.8 g瓊脂和3 g蔗糖溶解于100 mL蒸餾水中，pH 6.5，120℃滅菌25 min。（C）改進的合成培養基[6]：MgSO4720～740 mg/L，KNO370～90 mg/L，KCl 55～75 mg/L，Ca(NO3)2270～290 mg/L，EDTA-鐵鈉鹽5～12 mg/L，MnSO40.01～0.08 mg/L，CuSO40.01～0.03 mg/L，ZnSO40.1～0.4 mg/L，KI 0.01～0.03 mg/L，Na2MoO40.01～0.03 mg/L，CoCl2·6H2O 0.01～0.04 mg/L，H3BO30.3～0.6 mg/L，肌醇40～60 mg/L，維生素B 0.1～0.3 mg/L，吡哆醇0.1～0.3 mg/L，煙酸0.2～0.8 mg/L，pH 6.5，120℃滅菌25 min。（D）發根培養基：Ca(NO3)2·4H2O 359 mg/L，NaClO 10 mL/L，EDTA-鐵鈉鹽5 mg/L，蔗糖100 mg/L，微量元素1 mL/L，維生素1 mL/L，瓊脂8 mg/L，pH 6.5，120℃滅菌25 min。

1.1.3 主要試劑 用于配制消毒劑的試劑有：氯胺T（上海化學試劑公司），硫酸鏈霉素（華北制藥股份有限公司），硫酸慶大霉素（西南制藥廠），吐溫20（上海展云化工有限公司），75%酒精溶液等。

1.2 試驗方法

1.2.1 AMF孢子的篩選及提純 取在低溫儲藏的10 g真菌沙子菌樣，參照文獻[7]中的濕篩傾析法分離AMF菌孢子。

1.2.2 消毒液配制 按下述配方配制消毒液：混合消毒劑①，2%氯氨T＋0.05%的吐溫20[8]；混合消毒劑②，200 mg/mL硫酸鏈霉素＋100 mg/mL硫酸慶大霉素[9]；混合消毒劑③，1%氯胺T＋200 mg/L硫酸鏈霉素＋100 mg/L硫酸慶大霉素＋1%吐溫20處理5 min。

1.2.3 AMF孢子的消毒處理 試驗設計以下3種消毒處理。（1）在無菌條件下，移取0.5 mL孢子溶液到滅過菌的2 mL的離心管中，加入1.5 mL的混合消毒劑①，反復振蕩消毒30 min后用無菌濾網過濾；將孢子用無菌水清洗干凈后收集到2 mL離心管中，加入混合消毒劑②反復振蕩消毒25 min，過濾后用無菌水反復清洗，挑孢子于培養基上備用[10]。（2）將收集的孢子用無菌水沖洗過濾，孢子停留在濾網上；用10 mL 75%酒精浸泡5 s，用無菌水沖洗數遍；再倒入混合消毒劑③15 mL，浸泡6～7 min后，用無菌水沖洗10遍，挑孢子于培養基上。（3）將收集的孢子用無菌水沖洗過濾，孢子停留在濾網上；用經無菌濾膜過濾的混合消毒劑③15 mL，浸泡15 min后，用無菌水沖洗10遍，挑孢子于培養基上。

1.2.4 孢子接種與培養（1）接種。在顯微鏡下操作，將消過毒的孢子用無菌的槍頭挑取到不同培養基上，50個/皿，每種培養基3個培養皿，共4種培養基。（2）培養。接種后，將培養皿置26℃暗箱中培養20 d。在探索最佳消毒方法時采用0.8%瓊脂培養基進行培養，在探索最適培養基時采用處理3的消毒方法。

1.2.5 統計孢子萌發率 培養4、8、12、16、20 d時觀察孢子的萌發情況，以孢子芽管菌絲的長度等于或者大于孢子直徑時作為萌發標準[11]，統計萌發率；其中污染的孢子數不在統計之內。采用spss 17.0軟件對試驗數據進行方差分析，在5%水平下，檢驗不同處理的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同消毒處理對孢子萌發的影響

從表1中看出，培養4 d時，處理3的萌發率顯著高于處理1和處理2；隨著培養時間的延長，各處理的孢子萌發率也不斷提高；培養4～16 d，處理3的孢子萌發率均顯著高于處理1和處理2，但處理1和處理2之間的孢子萌發率無顯著差異；培養20 d時，各處理的孢子萌發率由高到低依次為處理3＞處理2＞處理1，且三者之間的差異均達顯著水平，處理3的孢子萌發率比處理1的高22.67個百分點。由此可知，處理3的消毒方法對AMF孢子的傷害性最小，其孢子萌發最快，萌發率也最高；而處理1的消毒方法對AMF孢子的傷害性最大，顯著降低了孢子的活力。

表1 不同消毒處理對孢子萌發的影響 （%）

2.2 不同培養基對孢子萌發的影響

由表2可知，AMF孢子在不同培養基上的萌發率表現出一定差異；其中，以A培養基（瓊脂培養基）的效果最好，孢子萌發快，且萌發率最高，培養20 d時，孢子萌發率分別比B、C、D培養基高19.67、32.67、29.00個百分點，且差異顯著；其次是B培養基（瓊脂蔗糖培養基），培養20 d時，孢子萌發率分別比C、D培養基的萌發率高13.00、9.33個百分點，且差異顯著；C和D培養基的效果較差，培養20 d時，孢子萌發率分別為48.00%和51.67%，兩者之間的差異不顯著。這說明，越是營養豐富的培養基，對AMF的萌發越不利。

表2 不同培養基對孢子萌發的影響 （%）

3 結論與討論

3.1 消毒處理

試驗在前人研究的基礎上，比較了3種不同的表面消毒法對AMF孢子萌發率的影響。其中，處理1較為常用，但是由于操作不便、消毒時間過長，盡管消毒效果最好，污染率較低，但同時對孢子活力的影響最大，顯著降低了孢子的萌發率，因此不建議采用。處理2是在仝瑞建等[8]的方法上略做改動，先用75%酒精浸泡5 s，再用1%氯胺T＋200 mg/L硫酸鏈霉素＋100 mg/L硫酸慶大霉素＋1%吐溫20混合液處理5 min，用無菌蒸餾水沖洗5～10次。此方法的孢子萌發率雖有顯著的提高，但同時污染幾率也相應增加。這可能是由于滅菌時間過短，消毒不徹底所造成的。為了解決這一問題，在處理3中做了進一步改進，即采用無菌過濾膜過濾消毒液，同時延長消毒液的處理時間至15 min，消毒后用無菌蒸餾水漂洗6～10次。該方法顯著降低了孢子培養過程中的污染率，而且對孢子的傷害較小，萌發率較高，消毒效果明顯。

3.2 培養基

根內球囊霉菌的適應性很強，萌發時不需要借助宿主植物[12]，而且其孢子較小，細胞壁較薄，對環境敏感，較少用作孢子萌發試驗材料。試驗中的根內球囊霉菌孢子對各處理未表現出敏感現象，這可能因為孢子是AMF的休眠體，對環境條件不敏感所致[13]。隨著培養時間的延長，孢子的萌發率不斷提高。在試驗所用的4種培養基中，以瓊脂培養基的孢子萌發率最高。這種培養基不含大量元素和糖類，孢子的萌發以及菌絲的生長不受其他元素的影響[14]。觀察發現，培養12 d時，瓊脂培養基上的孢子就開始長出菌絲，隨后菌絲迅速生長，培養20 d時，其菌絲長度達35 mm，遠遠大于其他培養基中孢子萌發的長度。而在瓊脂蔗糖培養基中孢子萌發率降低，可能是原因蔗糖的加入，改變了菌絲的生長環境，使菌絲難以吸收外界的營養物質，從而限制了菌絲的生長[13]，最終導致孢子萌發率降低。雖然合成培養基和發根培養基上的孢子萌發率較低，但這兩種培養基中所含元素最多。研究表明，萌發菌絲能夠吸收環境中的很多元素，元素濃度的高低直接影響菌絲活性。例如，Nagahashi等[15]研究不同磷元素濃度對發芽孢子的影響發現1 mmol/L的磷元素就能抑制菌絲分支，而當磷元素增加至10 mmol/L時，則顯著抑制菌絲的分支及生長；Hepper[16]的研究也表明30 mmol/L K2HPO4能夠抑制Glomus caledonium和Glomus mosseae的萌發和生長，過量的鹽也會抑制孢子的萌發以及菌絲的生長；而這些都有可能導致孢子萌發率的降低。

[1] Smith SE，Read DJ.Myeorrhizal symbiosis[M].UK：Cademic Press London，1997.

[2] Koide R G，Mosse B.A history of research on arbuscular mycorrhiza[J].Mycorrhiza，2004，（14）：145-163.

[3] Gilmore A E.Phytomycetous mycorrhizal organisms collected by open-pot culture methods[J].Hilgardia，1968，39：87-105.

[4]畢銀麗，汪洪鋼，李曉林.VA菌根真菌對轉移Ri T-DNA胡蘿卜根器官的侵染[J].植物營養與肥料學報，1999，5（1）：76-80.

[5] 董昌金，趙 斌.影響叢枝菌根真菌孢子萌發的幾種因素研究[J].植物營養與肥料學報，2003，9（4）：489-494.

[6] 金海如.叢枝菌根真菌孢子的高密度純種生產方法[P].中國：CN101565689，2009-05-26.

[7] Gerdemann J W，Nicolson T H.Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting[J].Transactions of the British Mycological Society，1963，46（2）：235-244.

[8] 仝瑞建，楊曉紅，蔣 猛.AM真菌孢子不同消毒方法的優化研究[J].西南農業大學學報（自然科學版），2005，27（6）：781-784.

[9] 董昌金，鄭世學，趙 斌.球囊霉屬幾種AM真菌孢子表面消毒與萌發的研究[J].菌物學報，2003，22（3）：410-416.

[10]田萌萌.叢枝菌根真菌吸收同化外源氮產生精氨酸的研究[D].金華：浙江師范大學碩士學位論文，2011.

[11]麻錦敏.AM真菌與紫云英轉化根共培養體系的建立和應用研究[D].武漢：華中農業大學碩士學位論文，2010.

[12]Schreiner R，Koide R T.Streptomycin reduces plant response to mycorrhizal infection[J].Soil Biology&Biochemistry，1993，25：1131-1133.

[13]朱紅惠，姚 青.pH值對Gigaspora margarita孢子萌發、菌絲生長與聚磷酸鹽含量的影響[J].菌物學報，2006，25（11）：120-124.

[14]Pawlowska T E，Charvat I.Heavy-metal stress and developmental patterns of arbuscular mycorrhizal fungi[J].Applied and Environmental Microbiology，2004，70（11）：6643-6649.

[15]Nagahashi G，Douds D D，Abney G D.Phosphorus amendment inhibits hyphal branching of the VAM fungus Gigaspora margarita directly and indirectly through its effect on root exudation[J].Mycorrhiza，1996，6（5）：403-408.

[16]Hepper C M.Effect of phosphate on germination and growth of vesicular arbuscular mycorrhizal fungi[J].Transactions of the British Mycological Society，1983，80：487-490.