32個茯苓菌株的SRAP分析*

蔡志欣 蔡丹鳳 陳美元 楊 菁 廖劍華 王澤生

（福建省農業科學院食用菌研究所，福州 350014）

茯苓[Wolfiporia cocos (Schwein.)Ryvarden& Gilb.]是一種高等擔子菌，隸屬于非褶菌目、多孔菌科、茯苓屬。茯苓是中國傳統中藥材之一，有著悠久的栽培歷史。近年茯苓產業發展迅速，但在茯苓生產中，由于菌種管理不夠規范，菌種生產單位各自命名，造成菌種名稱較為混亂，同種異名、同名異種現象普遍存在，極大地影響了產業的良性發展。

SRAP（sequence-related amplified polymorphis-m，序列相關擴增多態性）技術是Li等[1]在2001年發展的一種新型分子標記。該標記通過獨特的引物設計對開放閱讀框（ORFs）進行擴增，可因個體不同以及物種的內含子、啟動子與間隔區長度不等而產生多態性的擴增產物，具有簡便、穩定、在基因組中分布均勻等特點。本研究應用SRAP技術對源自各地的32個茯苓栽培菌株進行DNA指紋分析，以確定它們的親緣關系，清除種質資源庫中同種異名、同名異種的菌株，并篩選出特異性標記帶，為茯苓菌株的鑒定與選育提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）菌株。32個茯苓栽培菌株源自不同地區（表1），由福建省農業科學院食用菌研究所保藏并提供。

（2）試劑。PCR試劑盒及其他試劑均購自上海生工生物工程服務有限公司。

（3）引物。本研究所用SRAP上游引物和下游引物均參照Li和Quiros[1]，由華大基因上海鼎安生物科技有限公司合成。

1.2 試驗方法

（1）菌絲的培養。菌種接入常規PDA斜面培養基，25 ℃下培養14天。

（2）基因組DNA的提取。刮取適量斜面培養基上的菌絲，—70 ℃冰凍后砸碎，移入750 μL預冷的抽提緩沖液（100 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0；50 mmol/L EDTA；500 mmol/L NaCl；20 mmol/L NaHSO3）中，旋渦振蕩。加入100 μL 10% SDS，顛倒混勻，在65 ℃下保溫15 min，加入250 μL5 mol/L KOAc，再次混合均勻，冰上放置20 min。16 000 r/min離心5 min后，上清液用酚/氯仿抽提1次。再次同樣離心后，于上清液中加0.7倍體積的異丙醇，室溫沉淀10 min。離心收集沉淀，用70%乙醇洗1遍，吹干后溶于20 μL TE（含17 μg/mL RNaseA）中，通過瓊脂糖凝膠電泳檢查總DNA質量并定量后，置于—20 ℃下保存備用。

表1 供試茯苓菌株

（3）SRAP分析。根據文獻[1]中所述方法進行SRAP擴增，擴增條帶以NTSYSpc-2.02j軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 32個茯苓菌株的SRAP指紋圖譜分析

先用不同類型的少數菌株進行SRAP引物對的篩選，試驗發現me1-em5、me1-em7、me2-em4、me2-em6、me3-em10、me5-em9、me5-em10、me7-em6、me7-em8、me9-em16等 10對引物能產生較佳帶型并具有較好的重復性（SRAP引物序列見表2）。用這10對引物進行SRAP分析，共擴增出 23條穩定標記條帶，部分擴增結果見圖1～4。

2.2 32個茯苓菌株DNA標記條帶統計及聚類分析

表2 SRAP引物

圖1 32個茯苓菌株的SRAP擴增圖譜(引物對me1-em5)

圖2 32個茯苓菌株的SRAP擴增圖譜(引物對me1-em7)

將SRAP分子標記擴增獲得的23條特異條帶轉化成（1，0）數據表（擴增陽性記錄為“1”，擴增陰性記錄為“0”），使用NTSYSpc-2.02j軟件對（1，0）數據表進行分析和聚類，得到 32個菌株的親緣關系樹狀圖（圖5）。

圖3 32個茯苓菌株的SRAP擴增圖譜(引物對me2-em4)

圖4 32個茯苓菌株的SRAP擴增圖譜(引物對me9-em16)

圖5 32個茯苓菌株的親緣關系樹狀圖

通過對32個茯苓菌株進行SRAP聚類分析，結果供試的菌株在 0.38的相似值上可以分為兩個大的類群，其中菌株P6285單獨聚為一類；其余的31個菌株聚為一類。這31個菌株在0.76的相似值又可分為3個亞類群，其中川杰1號-A5、閩苓、鄂苓1號、茯苓Y1、貴習茯苓、同仁堂1號、岳西茯苓、茯苓DB等8個菌株聚在一起；合肥茯苓、茯苓5.78、河南茯苓3個菌株聚為一類，其余20個菌株聚為一個類群。供試的32個菌株中有28個菌株可以通過這組引物得以區分。

3 討 論

從試驗結果可以看出，菌株P6283的DNA帶型較為獨特，在聚類中單獨聚為一類。結合該菌株的生物學特性分析，該菌株可能為茯苓屬的其他種，或是在該菌株的保藏過程中污染了其他的雜菌。菌株川杰1號-A5和閩苓無法通過這23個標記分開，可能原因是閩苓是川杰1號-A5的直接誘變親本，親緣關系較近而無法通過這組SRAP標記找到差異，但我們之前使用RAPD標記技術卻可以較好地區分這兩個菌株[2]。菌株華中茯苓和W80694也無法通過這些SRAP標記分開，可能為同種異名，或需要更多的標記來區分。另從聚類結果也可以看出，供試的 32個菌株，除菌株P6283外，其他的菌株整體差異不大，雖然源自不同地區，但遺傳相似系數較高，表明所保藏的茯苓菌株整體遺傳背景較窄。這也與我們之前的研究以及曲直等應用RAPD技術對茯苓種質資源的研究結果較為一致[2,3]。

食用菌的分類目前多以生物學特性和農藝性狀為主要依據，其結果易受主觀和客觀因素的影響。利用DNA分子指紋可以從遺傳本質上對試驗的菌株進行比較，是近年來用以區分不同品種（菌株）的比較流行并可靠的手段[4～8]。本研究利用比較SRAP分子標記技術對所保藏的茯苓種質資源進行親緣關系評價，這些菌株涵蓋了國內的大部分主要栽培品種。試驗結果表明，供試的主要栽培品種間整體親緣關系較近，遺傳背景單一；也間接反映了國內的茯苓種質資源的整體情況。故在今后的遺傳育種中，引入新的野生種質或是引進國外的優良基因對茯苓優良品種的選育是非常重要的。同時本研究也為茯苓品種分類鑒定和遺傳育種的親本選擇提供了分子依據。

[1]Li G, Quiros CF.Sequence-related amplified polymorphism(SRAP), a mew marker system based on a simple PCR rea-ction: its application to mapping and gene tagging in Brass-ica[J]. Theor Apple Genet, 2001, (103): 455-461.

[2]蔡丹鳳, 陳美元, 郭仲杰, 等. 茯苓栽培菌株的RAPD分析[J]. 中國農學通報, 2010,26(20)：57-60.

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