禁水致脫水對大鼠睪丸網影響的形態定量研究

楊正偉，尹雨婷，郭 洋，朱金釵

(川北醫學院形態定量研究室，四川 南充 637000)

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筆者實驗室前期的研究［1－2］顯示，成年大鼠嚴重高糖高脂血癥5 ～6 周可能導致睪丸內精子釋放障礙，睪丸網增厚。這提示睪丸內精子向附睪的輸送可能受到一定程度的影響。鑒于嚴重高糖高脂血癥勢必引起脫水，而脫水又可能引起睪丸液(精子輸送的載體)分泌減少，我們設計了一個急性脫水模型(禁水)來初步探討脫水是否會影響精子的輸送［3］。本文利用該實驗所獲得的標本(另一側睪丸)，同時研究這個脫水模型是否也會引起睪丸網的形態改變，以推測精子輸送障礙(如果有的話)是否與精子輸出的狹窄通道(睪丸網)有關。

1 材料與方法

1.1 動物與切片

51 ～52 天齡雄性SD 大鼠隨機分成兩組，1 組常規給食(顆粒飼料)給水，1 組只給食不給水，均單籠飼養，4 ～5 d 后取材。一側(左或右，隨機交替確定)睪丸用于另一研究［3］，另一側用于本文。本文所用睪丸經Bouin 液浸潤固定2 d 后用70%乙醇保存，約半年后切取睪丸組織塊。

把每個睪丸的后上突出區域［2］看作一個水平面，以此為中心，沿水平面上的等距隨機方向［4］(一個睪丸一個方向)并垂直于水平面切取一個組織薄片(組織塊)，約2 mm 厚，貫穿整個睪丸，剖面大致垂直于水平面。

組織塊經脫水后用甲基丙烯酸樹脂(2-hydroxyethyl methacrylate，德國Leica Microsystems Nussloch GmbH 產品)包埋，然后沿組織塊剖面方向切片。前面大約200 μm(總厚)的切片不要，接著切6 張連續切片(每張10 μm 厚)用于觀測。切片用PAS(過碘酸與Schiff 試劑)和蘇木精染色。

1.2 切片觀察與測量

從每個睪丸選擇1 張染色效果較好的切片用于照相、拼圖。用體視學圖像系統(丹麥Visiopharm產品)所配置的日本Olympus 的BX51 型光學顯微鏡和20 ×物鏡(UplanSApo 型物鏡，其數值孔徑為0.75)觀察切片并照相(數碼)。照相前仔細觀察確定整個睪丸網的分布范圍，然后在有睪丸網的整個區域(包括鄰近的被膜與生精小管)重疊照相，用Photoshop 進行人工拼圖(圖像合成)后把整個睪丸網分布區域圖像打印在1 張A4 紙上，圖像放大倍數平均為89.0(44 ～155)。

在1 張A4 紙大小的透明膠片上用激光打印機打印一組間距為5 mm 的平行直線(測線)。把透明膠片隨機(盲法)置放在睪丸網圖像上，讓測線跨過整個睪丸網分布區域，且測線方向大致垂直于睪丸網的主要分布方向。每當測線與睪丸網的睪丸內側腔面或睪丸網瓣膜的被膜側腔面形成一個交點，就測量一個睪丸網寬度——從交點至睪丸網被膜側腔面的最近距離(圖1);每當測線與睪丸網的睪丸內側腔面形成一個交點，就測量一個睪丸網生精小管間距——從交點至生精小管基底面的最近距離(圖1)。用刻度為0.5 mm 的不銹鋼直尺測量這些距離，把測量結果分組記為0.25 mm、0.75 mm、1.25 mm……在4 幅睪丸網圖像上實際測得的睪丸網寬度個數少于10(為5 ～8)，因此再隨機疊加一次測線后對這4 幅圖像再測了1 次，結果取其均值。鑒于本文所用切片是大致垂直于睪丸網被膜側面的垂直切片，因此本文所測睪丸網寬度實際上約等于睪丸網(假設其為薄膜結構)的厚度，所測睪丸網生精小管間距實際上相當于睪丸網與生精小管之間結構(假設為薄膜結構)的厚度［4］。

2 結果

睪丸標本(包括切片)完好的共30 個，正常組與脫水組分別為19 和11 個。在正常組，測線與睪丸網的睪丸內側腔面、睪丸網瓣膜的被膜側腔面形成的交點總數分別為19.8 ±10.1、1.1 ±1.6(x－±s)，與脫水組(結果分別為19.8 ±8.1、3.0 ±2.9)相比無顯著性差異。(注:由于測線大致垂直于睪丸網的睪丸內側腔面或睪丸網瓣膜的被膜側腔面，這兩種交點數乘以測線間距5 mm 即分別為睪丸網的睪丸內側面、睪丸網瓣膜總高度的近似估計。)脫水組的后1 種交點數結果(相當于瓣膜高度)雖比正常組大3 倍左右，但由于變異大，兩組間差異無統計學意義(秩和檢驗的P 值為0.06)。

正常組睪丸網的平均寬度約為93 μm，脫水組的該寬度與之差異無統計學意義(表1)。正常組睪丸網生精小管間距約為38 μm，在脫水組該間距顯著減少約70%(表1)。

根據顯微鏡下的定性或半定量分析，只有脫水組的3 個動物在整個睪丸網腔內可見20 ～40 個精子，其余動物的睪丸網腔內均幾乎見不到任何精子(表2)。不過，兩個組的睪丸網腔內均可見較多的球形精子細胞，且脫水組的球形精子細胞數似更多(表2)。

在脫水組，每幅(每個動物)睪丸網圖像上均見睪丸網“擠壓”生精小管的形態特征，即部分睪丸網突向部分生精小管壁，且該區域生精小管壁向小管內凹陷，在3 幅圖像上甚至可見被“擠壓”生精小管壁變薄(與對側小管壁相比);而在正常組，任一睪丸網圖像上均未見這樣的形態特征(圖1)。

表1 青春期大鼠睪丸網寬度和睪丸網生精小管間距

3 討論

本文研究顯示，青春期雄性SD 大鼠禁水4 ～5 d 后，睪丸網沒有增寬(與對照動物相比)，但其內壓升高，且腔內精子與未成熟生精細胞(球形精子細胞等)增多。這提示，睪丸網向附睪輸送睪丸內產生的精子和未成熟生精細胞的功能較活躍。正常狀態下，成年大鼠睪丸網腔內［2］或生精小管腔內［5］少見精子或長形精子細胞，可能是因為這些腔隙窄小，且精子一旦釋放很快就會被輸送到附睪。在本文中的脫水組，睪丸網腔內不僅見較多的精子，也見較多的未成熟生精細胞，這是因為脫水組生精上皮的生精細胞排列疏松、提前脫落并輸送到附睪［3］。因此，禁水致脫水這種狀態與高糖高脂血癥所致生精小管和睪丸網改變［1－2］可能大不相同。

之所以推測脫水組睪丸網內壓較高，是因為睪丸網與生精小管間距縮短，尤其是睪丸網突向生精小管使生精小管壁凹陷甚至變薄(圖1)。睪丸網內壓增高的原因可能不是睪丸網內液體(睪丸液)增多(短期禁水致脫水勢必不會增加睪丸液的分泌)，而可能是大量(相對于較小的睪丸網腔隙來講)未成熟生精細胞脫落［3］，甚至生精小管周細胞的收縮較活躍(目前尚無證據)。至于內壓升高為什么沒引起睪丸網增寬，可能是因為實驗時間尚短，且內壓增高可能引起睪丸網形狀不規則(瓣膜傾向于增高就是證據)而不表現為整體增寬。

本文以睪丸后上突出區域為中心切取組織塊，結果都切到睪丸網，說明睪丸網確實主要分布在睪丸后上區域［2］。不過，肉眼切取組織塊時，我們實際上看不到睪丸網的中心或出口處，因此這可能增加睪丸網寬度的組織塊間(器官內)變異，進而增加最后結果的總變異(表1，其中的標準差結果較大)。

采用同樣的甲基丙烯酸樹脂包埋切片，并采用相似的形態定量方法的研究顯示，正常成年(15.5 ～16.5 周齡)雄性SD 大鼠的睪丸網寬度(厚度)平均為16.3 ±8.3(8.1 ～28.0)μm，本文研究的正常青春期(8 周齡)雄性SD 大鼠的睪丸網寬度(厚度)是這個結果的5 倍多。這說明隨著精子發生的成熟、精子數量的增多，睪丸網會變得越來越薄，直至變成一個狹窄的縫隙而已。注意，睪丸網(成年動物［1－2］)雖然狹窄了，但通過它輸送的精子顯然要多得多(與本文的青春期動物［3］相比)。由此可見，睪丸網的寬度實際上不能有效反映精子輸送是否更多、是否更快。

［1］ 廖 波.高糖高脂血癥對大鼠睪丸和附睪組織結構的影響的體視學研究［D］.四川南充:川北醫學院，2010

［2］ 廖 波，鄧顯忠，代小思，等.成年SD 大鼠睪丸網的分布［J］.川北醫學院學報，2010，25(3):199 －208

［3］ 朱金釵，郭 洋，向 宇，等.禁水致脫水對大鼠睪丸內精子輸送影響的初步形態定量研究［J］.川北醫學院學報，2013，28(3):200 －206

［4］ 楊正偉.生物組織形態定量研究基本工具:實用體視學方法［M］.北京:科學出版社，2012.40 －52，125 －130

［5］ Wen XH，Yang ZW.Quantitative (stereological)study on the spermatozoal storage capacity of epididymis in rats and monkeys［J］.Asian J Androl，2000，2(1):73 －77