穿刺抽吸法誘導(dǎo)兔椎間盤退變模型

白亦光，韓小偉，張旭乾，陳華平，趙 明，劉 康，陳 竹，楊澤龍，倪 偉，馮 剛

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院組織工程與干細(xì)胞研究所·南充市中心醫(yī)院;2.南充市中心醫(yī)院病理科;3.南充市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，四川 南充 637000)

本刊網(wǎng)址: http: / /www.nsmc.edu.cn 作者投稿系統(tǒng): http: / /noth.cbpt.cnki.net 郵箱: xuebao@ nsmc.edu.cn

椎間盤退行性變(intervertebral disc degeneration，IDD)是引起下腰痛的主要原因，它可引起一系列疾病如腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄癥、節(jié)段性腰椎不穩(wěn)和退變性腰椎側(cè)凸等。目前關(guān)于IDD 的病因和病理生理機(jī)制尚未完全明確。椎間盤退變的過程牽涉到一系列復(fù)雜的形態(tài)學(xué)、生物力學(xué)、生物化學(xué)和生物學(xué)行為的改變［1］。一種可靠的椎間盤退變動物模型必將有助于椎間盤退變的病理機(jī)制研究。椎間盤退行性變模型的制作國內(nèi)外已有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)使用纖維環(huán)穿刺法建立兔椎間盤退變模型，觀察退變椎間盤的影像學(xué)和組織病理學(xué)表現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及實(shí)驗(yàn)方法

取10 月齡日本大白兔12 只(川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，雌雄不限，體重2.5 ～3.0 kg。經(jīng)MRI 檢查排除脊柱的先天性畸形和椎間盤退變。所有動物以濃度為10 mg/mL 的戊巴比妥3 mL/kg 進(jìn)行耳緣靜脈注射麻醉。取仰臥位，備皮后常規(guī)碘伏消毒，取腹部正中切口，切口長約10 cm，小心將腸管翻出，分離椎體前方肌肉，保護(hù)椎體前方動脈血管，暴露L1 ～2 至L6 ～7 節(jié)段椎間盤。其中L3 ～4、L4 ～5、L5 ～6 節(jié)段椎間盤用21 號針頭接5 mL 注射器在椎間隙纖維環(huán)的中點(diǎn)平行于終板方向刺入纖維環(huán)5 mm，回抽注射器針筒至3 mL 處維持15 s，抽取髓核組織約8 ～10 mg。L1 ～2、L2 ～3 及L6 ～7 節(jié)段只暴露椎間盤不做穿刺抽吸。術(shù)畢逐層縫合創(chuàng)口，大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射青霉素80 萬U 抗感染。動物分別于術(shù)后4、8、12、16 周各取3 只進(jìn)行指標(biāo)檢測MRI檢查，然后處死實(shí)驗(yàn)動物獲取椎間盤，利用病理組織學(xué)觀察。

1.2 檢測指標(biāo)

1.2.1 MRI 檢查 分別于術(shù)后2、4、8、12 周每組隨機(jī)選取2 只動物麻醉后(麻醉方法同上)進(jìn)行MRI檢查。取仰臥位對兔腰椎行T2加權(quán)像(T2WI)掃描，系列重復(fù)時(shí)間/回波時(shí)間(TR/TE)為2 800/100 ms，層厚3 mm，間距0.5 mm。以Pfirrmann 改良分級法［2］作為評估標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)T2WI 像兔椎間盤信號強(qiáng)度將退變分為4 級:4 級，正常椎間盤;3 級，信號部分減弱;2 級，信號完全減弱;1 級，信號完全減弱伴椎間盤高度丟失。所有MRI 影像資料均由放射科醫(yī)師盲法閱片評估。

1.2.2 大體形態(tài)學(xué)觀察 術(shù)后2、4、8、12 周10 mg/mL 的戊巴比妥6 mL/ kg 過量麻醉處死動物，取各動物L(fēng)2 ～3(假手術(shù)對照節(jié)段)、L3 ～4(穿刺抽吸節(jié)段)椎間盤標(biāo)本，10%多聚甲醛固定24 h，矢狀位切開椎間盤標(biāo)本，觀察纖維環(huán)和髓核分界是否清楚，髓核是否為膠凍狀。

1.2.3 椎間盤組織病理學(xué)表現(xiàn) 取各動物L(fēng)6 ～7(假手術(shù)對照節(jié)段)、L5 ～6(穿刺抽吸節(jié)段)椎間盤標(biāo)本，10%多聚甲醛固定，脫鈣液脫鈣6 d，矢狀位切開椎間盤標(biāo)本，石蠟包埋切片(片厚5 μm)、番紅“O”染色觀察，并用倒置顯微鏡照相采集圖像。番紅“O”染色流程:切片二甲苯酒精脫蠟至水;蘇木素染10 min，水洗;0.2%亮綠染色10 min，水洗;0.1%番紅“O”染色10 min，1%醋酸酒精分化液3 s，封片后鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MRI 表現(xiàn)

造模手術(shù)后4 周開始，纖維環(huán)穿刺組髓核T2WI信號明顯下降(P ＜0.05)。造模術(shù)后4、8、12、16 周髓核T2WI 信號隨時(shí)間延長逐步降低，高信號面積逐漸縮小，假手術(shù)對照節(jié)段的髓核信號強(qiáng)度在觀察期內(nèi)無明顯變化(圖1);各時(shí)間點(diǎn)椎間盤分級的分值見表1，從術(shù)后4 周開始兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表1 椎間盤退變MRI 分級

2.2 大體形態(tài)學(xué)觀察

術(shù)后4 周，穿刺抽吸節(jié)段椎間盤均出現(xiàn)不同程度椎間盤高度降低，纖維環(huán)紋理清晰，結(jié)構(gòu)完整，未見骨性贅生物形成;8 周時(shí)穿刺抽吸節(jié)段椎間盤可見椎體邊緣贅生物，為纖維環(huán)鈣化形成，纖維環(huán)可見結(jié)構(gòu)紊亂，髓核失去凝膠狀形態(tài);12 周出現(xiàn)明顯退變，椎間盤高度丟失，椎緣出現(xiàn)骨性贅生物，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)紊亂，髓核變性，結(jié)構(gòu)模糊。假手術(shù)對照節(jié)段各椎間盤高度維持良好，髓核呈透明凝膠狀，椎體緣無增生組織(圖2)。

2.3 組織病理學(xué)表現(xiàn)

假手術(shù)對照組動物椎間盤結(jié)構(gòu)髓核完整，與纖維環(huán)分界清楚，染色呈紅色，纖維環(huán)排列有序，髓核內(nèi)可見成團(tuán)分布的髓核細(xì)胞簇，細(xì)胞外基質(zhì)豐富;纖維環(huán)穿刺組番紅“O”組織染色顯示退變椎間盤組織中髓核組織含量隨時(shí)間延長明顯降低，造模術(shù)后4 周髓核組織中髓核細(xì)胞含量減少，形態(tài)不規(guī)則，分布不均勻，纖維軟骨組織增生，排列紊亂。第12 周時(shí)髓核中主要為纖維軟骨組織，伴有極少量髓核細(xì)胞(圖3)。

3 討論

人類椎間盤退變早期病理學(xué)改變主要表現(xiàn)為蛋白多糖、Ⅱ型膠原含量的減少進(jìn)而髓核的含水量下降［3］。關(guān)于椎間盤退變的原因目前尚不清楚［4］，其發(fā)病機(jī)制機(jī)制和早期治療修復(fù)的方法一直是近年來的研究熱點(diǎn)［5］。建立一個(gè)好的模型有助于我們進(jìn)行椎間盤退變的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)日本大白兔采用經(jīng)腹纖維環(huán)穿刺抽吸法具有手術(shù)暴露充分、操作性好、切口大小易于掌握、重復(fù)性好、模型制作成功率高等優(yōu)點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過MRI 來觀察造模術(shù)后隨著時(shí)間延長兔椎間盤退變的程度。MRI 能夠提供清晰的椎間盤圖像，是評估椎間盤退變常用的評價(jià)方法。退變椎間盤由于內(nèi)部蛋白多糖及水分丟失造成的改變，以及Ⅱ型膠原的減少及Ⅰ型膠原的增加使椎間盤抗壓縮和拉伸性能減弱，導(dǎo)致椎間盤生物學(xué)性能發(fā)生改變，這些變化表現(xiàn)在MRI 上，可看到代表含水量的T2WI 信號強(qiáng)度減弱并有椎間隙狹窄［6］。本實(shí)驗(yàn)造模術(shù)后椎間盤髓核組織MRIT2WI 信號強(qiáng)度呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，術(shù)后時(shí)間越長髓核組織退變越明顯，而假手術(shù)對照組的髓核組織T2WI 信號強(qiáng)度無明顯變化。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)通過纖維環(huán)穿刺髓核抽吸方法可以誘導(dǎo)大白兔椎間盤發(fā)生退變，這種退變是一個(gè)緩慢漸進(jìn)的過程，較為符合人類椎間盤退變的病理變化。

椎間盤組織番紅“O”染色顯示，假手術(shù)對照節(jié)段椎間盤可見髓核組織完整，外周纖維環(huán)呈環(huán)狀排列，可見明顯的軟骨細(xì)胞及基質(zhì);穿刺抽吸節(jié)段椎間盤術(shù)后4 周見椎間盤組織染色呈紅色，中央髓核區(qū)域類結(jié)構(gòu)模糊，出現(xiàn)裂隙，細(xì)胞數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)較正常髓核致密，纖維粗大，排列紊亂，椎間盤高度降低。術(shù)后8 周后可見整個(gè)中央髓核區(qū)域類圓形結(jié)構(gòu)消失，與周圍纖維環(huán)組織融合，出現(xiàn)排列紊亂的條索樣纖維結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)裂隙，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，椎間盤高度降低。術(shù)后12 周髓核番紅“O”染色顯示，髓核組織中條索樣纖維結(jié)構(gòu)更加紊亂，蛋白聚糖含量明顯減少，椎間盤高度明顯降低。

有研究者認(rèn)為髓核組織是與機(jī)體免疫系統(tǒng)相隔絕的，為免疫豁免組織，纖維環(huán)或軟骨終板這一生理屏障受到破壞后，髓核組織就暴露于機(jī)體的免疫系統(tǒng)之中，進(jìn)而激發(fā)一系列的自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致髓核細(xì)胞凋亡進(jìn)而椎間盤退變［7］。本方法即模擬這一發(fā)病機(jī)制，通過穿刺抽吸將髓核暴露于機(jī)體免疫系統(tǒng)。符合人類腰椎間盤退變的基本病理過程，且模型制作較為簡單，重復(fù)性好，可以作為研究椎間盤退變的動物模型，構(gòu)建的椎間盤退變模型能為進(jìn)一步研究椎間盤退變的病理機(jī)制及臨床治療提供可靠科研平臺。

［1］ 崔力揚(yáng)，劉尚禮，丁 悅，等.大鼠腰椎間盤針刺退變模型的建立［J］.中國矯形外科雜志，2007，15(13):1008 －1011

［2］ Pfirrmann CW，Metzdorf A，Zanetti M，et al.Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration ［J］.Spine，2001，26(117):1873 －1878

［3］ Niosi CA，Oxland TR.Degenerative mechanics of the lumbar spine［J］.Spine J，2004，4(6 Suppl):202S－208S

［4］ Haixiang Liang，Shen-Ying Ma，Gang Feng.Therapeutic effects of adenovirus-mediated growth and differentiation factor-5 in a mice disc degeneration model induced by annulus needle puncture［J］.The Spine Journal，2010，10(1):32 －34

［5］ Zhou H，Hou S，Shang W，et al.A new in vivo animal model to create intervertebral disc degeneration characterized by MRI，radiography，CT/discogram，biochemistry andhistology ［J］.Spine，2007，32(8):864 －872

［6］ Marinelli NL，Haughton VM，Mu?oz A，et al.T2 relaxation times of intervertebral disc tissue correlated with water content and proteoglycan content［J］.Spine (Phila Pa 1976)，2009，34(5):520 －524

［7］ Urban JP，Roberts S.Degeneration of the intervertebral disc［J］.Arthritis Res Ther，2003，5(3):120 －130