體外共培養(yǎng)誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向軟骨表型細(xì)胞分化及鑒定的實(shí)驗(yàn)研究

蔣 婷，楊澤龍，劉 康，陳 竹，白亦光，李凌云，白 倩，馮 剛

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院·南充市中心醫(yī)院燒傷整形美容外科，四川 南充 637000;2.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院·南充市中心醫(yī)院骨科，四川 南充 637000;3.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院組織工程與干細(xì)胞研究所，四川 南充 637000)

隨著我國人口老齡化的到來，關(guān)節(jié)軟骨退變與缺損病人逐年呈上升趨勢，是臨床醫(yī)生面臨的又一重大挑戰(zhàn)。一般情況下，關(guān)節(jié)軟骨創(chuàng)傷或退變?nèi)睋p一旦超過4 mm就很難自身修復(fù)，采用自身軟骨移植來修復(fù)軟骨缺損成為臨床治療的一種新方法，具有遠(yuǎn)大的前景。但是，自身軟骨來源比較困難且增殖能力有限，很難滿足實(shí)際的應(yīng)用。隨著組織工程研究的不斷進(jìn)展，脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cells，ADSC)的應(yīng)用潛能越來越受到研究者的關(guān)注并成為熱點(diǎn)［1-3］。有大量研究表面，ADSC經(jīng)過不同誘導(dǎo)因子的作用，可以向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和成骨細(xì)胞等分化。特別是其向軟骨細(xì)胞方向分化的潛能越來越受到人們的重視。然而繼往的誘導(dǎo)方法主要是應(yīng)用多種不同的誘導(dǎo)因子來進(jìn)行，操作過程復(fù)雜，難以實(shí)際應(yīng)用于臨床。本研究通過將軟骨細(xì)胞與ADSC共培養(yǎng)，利用軟骨細(xì)胞分泌相關(guān)因子提供的微環(huán)境，將ADSC成功定向誘導(dǎo)為軟骨表型細(xì)胞，有望為臨床軟骨缺損的修復(fù)和軟骨組織工程提供一種新的種子細(xì)胞來源的方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料

清潔級(jí)2周齡日本大耳白兔，雌雄不限，體重0.4～0.6 kg，由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DMEM培養(yǎng)液及胎牛血清(Gibco公司)，胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、復(fù)合膠原酶(NB4)、反轉(zhuǎn)錄酶(Sigma公司)，transwell小室(孔徑 0.4 μm，Caster，美國)，番紅及甲苯胺藍(lán)染液(南京夏斯生物)等。

1.2 方法

2周齡日本大耳白兔空氣栓塞處死后，按無菌操作取下肋軟骨與腹股溝皮下脂肪。

1.2.1 軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 將肋軟骨剪碎至0.3～0.5 mm大小，2.5%胰酶37℃消化30 min，2000 r/min×5 min離心取沉淀，PBS洗3次，再用1%的復(fù)合膠原酶(NB4)37℃消化約8 h，200目濾網(wǎng)去除未消化軟骨塊。濾液離心，PBS液洗3次后得到軟骨細(xì)胞，將軟骨細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3天換液，細(xì)胞生長至瓶底的80%到90%傳代，取P1代細(xì)胞備用。

1.2.2 ADSC的分離與培養(yǎng) 將兔腹股溝脂肪盡量剪碎，加入0.75 g/LⅠ型膠原酶37℃消化1 h，中和Ⅰ型膠原酶，200目濾網(wǎng)去除未消化脂肪團(tuán)塊，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液懸浮1 500 r/min×5 min離心，將沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液10 min后再次以1 500 r/min×5 min離心去上清后獲得ADSC，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液懸浮接種，每3天換液，細(xì)胞生長至瓶底的80%到90%傳代，取P1代細(xì)胞備用。

1.2.3 軟骨細(xì)胞與ADSC共培養(yǎng) 將P1代軟骨細(xì)胞和ADSC制作成細(xì)胞懸液，軟骨細(xì)胞按1.0×105/L接種于6孔培養(yǎng)板共12孔，24 h觀察軟骨細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)液，在其中的6孔中放入transwell小室，膜底與貼壁細(xì)胞相接觸，然后在transwell小室中按ADSC比軟骨細(xì)胞細(xì)胞為3∶1的比例接種軟骨細(xì)胞;其它6孔放入transwell小室，不接種軟骨細(xì)胞作為對照。每孔均加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液3 mL培養(yǎng)，每3天采用半量換液，共培養(yǎng)2周。

1.2.4 誘導(dǎo)后ADSC的檢測 safranin-O和甲苯胺藍(lán)染色觀察誘導(dǎo)后ADSC蛋白多糖的分泌情況，Ⅱ型膠原免疫化學(xué)染色觀察誘導(dǎo)后ADSCⅡ型膠原分泌情況;rt-PCR檢測Ⅱ型膠原基因表達(dá)情況，按試劑盒的說明操作。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

軟骨細(xì)胞接種培養(yǎng)24后貼壁，細(xì)胞伸展后呈多角形，6 d左右可達(dá)90% 以上融合;ADSC原代呈集落生長而傳代后呈梭形，排列規(guī)則(圖1)。

2.2 safranin-O染色

safranin-O染色顯示與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)2周后，ADSC的胞漿出現(xiàn)紅染。單獨(dú)的ADCS培養(yǎng)對照組僅顯示微弱的淡紅，而大部分細(xì)胞顯示為亮綠染料的淡綠色(圖2)。

2.3 甲苯胺藍(lán)染色

甲苯胺藍(lán)染色顯示與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)2周后，ADSC的胞漿出現(xiàn)藍(lán)色。而對照組僅顯示微弱的淡藍(lán)色，這說明共培養(yǎng)后的ADSC有蛋白多糖表達(dá)(圖3)。

2.4 Ⅱ型膠原的免疫細(xì)胞化學(xué)染色

免疫細(xì)胞化學(xué)顯示與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)2周后，ADSC的胞漿中出現(xiàn)較多的粗大棕色顆粒，未共培養(yǎng)組細(xì)胞沒有顯色，僅有非特異的異染。說明共培養(yǎng)后ADSC表達(dá)了Ⅱ型膠原(圖4)。

2.5 rt-PCR檢測Ⅱ型膠原基因表達(dá)

與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)2周后，ADSC具有與軟骨細(xì)胞接近的Ⅱ型膠原基因轉(zhuǎn)錄水平，而對照組則為陰性(圖5)。

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨退行性變或外傷引起的軟骨缺損是一種常見病、多發(fā)病，是導(dǎo)致中老年人關(guān)節(jié)疼痛、運(yùn)動(dòng)功能障礙的最主要原因之一。在年齡超過50歲的人群中，關(guān)節(jié)軟骨退行性變致殘的發(fā)病率僅次于心血管疾病。正常的關(guān)節(jié)軟骨由于沒有神經(jīng)及血管組織，其營養(yǎng)主要依靠彌散機(jī)制，從滑膜分泌的滑液中攝取，且關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝緩慢，一旦發(fā)生缺損，其愈合能力非常有限，關(guān)節(jié)軟骨損傷后的修復(fù)主要是細(xì)胞的反應(yīng)性增殖，但多數(shù)人認(rèn)為這種機(jī)制并不能使受傷軟骨完全修復(fù)，一旦損傷發(fā)生即成為永久性病變［4-5］。有許多研究者進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨或軟骨細(xì)胞移植來治療關(guān)節(jié)軟骨退變?nèi)睋p，取得了一定的臨床效果，但是軟骨的來源不足使細(xì)胞移植或軟骨移植應(yīng)用于臨床的受到很大的限制。組織工程化軟骨是軟骨移植修復(fù)缺損的另一個(gè)研究熱點(diǎn)，但種子細(xì)胞的來源不足仍然是目前組織工程軟骨發(fā)展的關(guān)鍵瓶頸［6-9］。

ADSC是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)ADSC細(xì)胞能夠在體外穩(wěn)定增殖且衰亡率低，同時(shí)它具有取材容易、少量組織即可獲取大量干細(xì)胞，適宜大規(guī)模培養(yǎng)，對機(jī)體損傷小等優(yōu)點(diǎn)，而且其來源廣泛，體內(nèi)儲(chǔ)備量大，適宜自體移植，逐漸成為近年來新的研究熱點(diǎn)。Zuk等［10］從人體抽吸的脂肪組織中分離培養(yǎng)出成纖維樣細(xì)胞，此細(xì)胞能在體外穩(wěn)定擴(kuò)增，使用免疫熒光和流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞大部分來源于中胚層或間充質(zhì)，在一定條件下可以向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化。Gronthos等［11］對脂肪抽吸物培養(yǎng)細(xì)胞的表面標(biāo)記研究表明，這些細(xì)胞具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的表面抗原表達(dá)，這說明脂肪來源細(xì)胞中的確存在間充質(zhì)干細(xì)胞特性的細(xì)胞，稱為脂肪組織來源干細(xì)胞，脂肪干細(xì)胞的概念由此正式提出。此后人們對脂肪干細(xì)胞作了大量的研究［12-14］，取得了許多重要的進(jìn)展。這為脂肪干細(xì)胞應(yīng)用于軟骨組織工程構(gòu)建和臨床治療帶來了希望。

在以往的許多研究中，脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成軟骨表型細(xì)胞需要許多誘導(dǎo)因子諸如 TGF-β1、GDF-5、IGF-I、BMP-2等，操作過程復(fù)雜、條件要求苛刻、花費(fèi)較高，難以應(yīng)用于臨床。本研究采用軟骨細(xì)胞與ADSC共培養(yǎng)的方式，通過軟骨細(xì)胞提供的微環(huán)境，成功地將ADSC誘導(dǎo)成軟骨表型細(xì)胞。經(jīng)過safranin-O染色、甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫化學(xué)染色和rt-PCR檢測證實(shí)了經(jīng)過誘導(dǎo)后的ADSC能表達(dá)軟骨細(xì)胞特有的細(xì)胞外基質(zhì)。該方法操作簡單、成本低廉、技術(shù)要求不高，有利于促進(jìn)ADSC在軟骨組織工程或臨床方面的應(yīng)用。但是其誘導(dǎo)的穩(wěn)定性和能否良好地修復(fù)軟骨缺損仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

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