兔骨髓間充質干細胞的分離培養及鑒定

劉 康，白亦光，陳 竹，韓小偉，楊澤龍，趙 明，宋桂芹，馮 剛

(1.川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院組織工程與干細胞研究所，四川南充 637000;2.川北醫學院醫學生物學教研室，四川南充 637007)

骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是一類來源于骨髓組織的具有強大增殖能力和多向分化潛能的干細胞［1］，具有向中胚層組織及神經外胚層組織分化的能力，在不同的誘導條件下能分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞和成肌細胞等。骨髓間充質干細胞因其來源廣、容易獲取、無醫學倫理學爭議等優勢，被認為是目前骨組織工程最為理想的種子細胞來源［2-3］。本研究對BMSCs的原代培養技術進行探討，旨在摸索出一種更為簡便有效的獲取更高純度和更多數量BMSCs的培養方法，同時觀察BMSCs在體外環境培養下的生物學特性，從而解決骨組織工程研究中種子細胞來源的問題。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

出生2～3周的新西蘭兔5只，雌雄不限，質量0.4～0.6 kg，由川北醫學院實驗動物中心提供。

1.2 試劑及儀器

DMEM培養液、胎牛血清購自Hyelone公司。PercoⅡ分離液購自博士德生物公司。噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自GIBCO公司。β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素c、胰島素、番紅、快綠、素木精等購自Sigma公司、DAB試劑盒購自碧云天公司。CO2培養箱、高速離心機購自Thermo公司。倒置相差顯微鏡購自NIKON公司。

1.3 方法

1.3.1 兔BMSCs的分離與培養 取1月齡新西蘭大白兔(雌雄不限)，耳緣靜脈注射空氣處死。75%酒精浸泡消毒15～20 min后無菌操作下切開后肢皮膚、肌肉，去盡附著在骨上的肌肉、筋膜等軟組織，分離出股骨和脛骨。用眼科剪從股骨和脛骨的干骺端打開骨髓腔，用含有適量肝素(625 U/mL)的DMEM液沖洗骨髓腔，收集沖洗液約6～8 mL。吸管反復吹打后，1 500 r/min，離心5 min，棄上清。加入DMEM培養基4 mL重懸，將上述細胞重懸液按照1∶1的比例緩慢滴加到密度為1.073 g/mL的PercoⅡ分離液中，1 500 r/min離心30 min。離心后管內容物分為3層，收集中間乳白色云霧狀的單個核細胞層，加入DMEM培養液稀釋混勻，1 500 r/min離心5 min，洗滌2～3次，去除多余的脂肪細胞及組織液。用含雙抗的10%胎牛血清的DMEM培養基重懸細胞，以2.0×105個/cm2的細胞密度接種于培養瓶中，置于37℃，5%、飽和濕度的孵箱中培養。

1.3.2 BMSCs的純化和擴增 利用差異貼壁培養法純化細胞。第1次于48 h后棄掉未貼壁的細胞，更換新鮮培養液。以后每3天換液1次。待細胞長到80%融合，用0.25%胰蛋白酶1 mL消化，血清終止后，將消化后的細胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含胎牛血清10%，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL的DMEM細胞培養液重懸，靜置1 min后，將上清液以8.0×104個/cm2的細胞密度移入培養瓶內，置37℃，5%CO2，pH 7.5，飽和濕度的培養箱內培養。

1.3.3 細胞形態學觀察 用倒置相差顯微鏡逐日觀察體外培養原代及傳代BMSCs的生長、增殖及形態特征，并拍照記錄。

1.3.4 生長曲線的繪制 分別取第1、3代和第8代細胞，胰蛋白酶消化，血清終止，培養基重懸，將細胞濃度調整至1×104/mL。接種于96孔板中，每孔200 μL。待細胞完全貼壁后(約24 h)后更換無血清DMEM培養基，24 h后，將培養液換為含10%FBS的 DMEM完全培養液，于37℃、100%濕度、5%CO2孵箱中培養，適時換液。每天固定時間隨機抽取5孔細胞，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續培養4～6 h，吸凈孔內液體，每孔中加入150 μL的DMSO，振蕩10 min，在酶聯免疫測定儀上用波長為490 nm的濾光片測定每孔的吸光度，直至貼壁細胞鋪滿培養孔底部，取5孔吸光度均值，以時間(d)為橫坐標，吸光度(OD)為縱坐標繪制生長曲線。

1.3.5 細胞貼壁率檢測 取第1、3、5代處于對數生長期的細胞，制成5×107/L的細胞懸液接種于24孔板中，每隔2 h隨機選取3個培養孔，吸取培養液與未貼壁細胞，0.25%胰蛋白酶消化，計算每孔細胞數，取均值，連續測定20 h，計算細胞貼壁率。

1.3.6 成軟骨細胞的體外誘導分化 將第3代的細胞懸液以105個/cm2細胞濃度接種24孔培養板中，各孔加入0.5 mL成軟骨誘導培養液(體積分數10%胎牛血清的高糖DMEM培養基、50 mg/L維生素 C、0.272 g/L L-谷氨酰胺、6.25 mg/L 胰島素、6.25 mg/L亞硒酸、1.25 g/L牛血清白蛋白、1 mmol/L丙酮酸鹽、5.35 mg/L亞油酸、10 mg/L轉化生長因子TGF-β、10～7 mol/L地塞米松)，每3天全量換液。誘導2周后進行番紅快綠染色及甲苯胺藍染色。

2 結果

2.1 原代細胞培養結果

剛接種的細胞鏡下呈圓形，大小較均一，24 h后見部分貼壁的細胞呈梭型或三角形，視野中有較多懸浮的紅細胞。3 d后，細胞逐漸鋪開，出現散在的紡錘狀貼壁細胞，且呈克隆樣生長，10～14 d后形成克隆，快速分裂增殖形成細胞團簇，呈放射狀排列，直徑大小不等。細胞貼壁稀疏時，細胞輪廓呈長梭形，細胞的兩極朝向不規律，細胞排列混亂，少量細胞呈星形，胞漿豐富。隨著培養時間的延長，這些貼壁細胞形成集落，集落大小不一，此時細胞的兩極開始有規律的排列成束狀(圖1)。

2.2 傳代細胞培養結果

傳代細胞為梭形、多角形，平鋪生長，不再形成明顯集落，分布均勻。傳代后細胞生長迅速，約2～3 d細胞融合可達90%，呈旋渦狀排列。傳代后細胞形態上無明顯改變，隨著傳代次數的增加細胞開始老化，細胞形態變為扁平、寬大、遮光性差，增殖速度明顯減慢直至停止。

2.3 兔BMSCs的生長曲線

經MTT法測定細胞活性并繪制細胞增殖曲線，對比第1、3、5代細胞的細胞生長曲線可發現，各代細胞均有24～48 h的潛伏期，一般從第48 h后進入對數生長期，生長迅速，第6～7天即可達單層融合進入平臺期，第9天后細胞出現生長抑制(圖2)。

2.4 細胞貼壁率

隨著培養時間的延長，MSCs貼壁率逐漸上升，第1、3代細胞貼壁率基本無差異，接種12 h后貼壁率分別為96%和95%。第5代細胞貼壁能力較第1代、第3代細胞略有下降，為90%(圖3)。

2.5 成軟骨誘導

加入成軟骨誘導液后，細胞擴增速度明顯減緩甚至停止，在培養的第7天少量細胞由長梭形漸變為多角形或立方形，隨著時間的延長，多角形的細胞增多并聚集成團。經甲苯胺藍染色和番紅快綠染色后，可見細胞表現出軟骨細胞特征，細胞外基質極其豐富(圖4)。

3 討論

骨髓間充質干細胞易于分離培養，在體外特定的誘導條件下可分化為多種功能細胞，在組織工程、細胞替代治療、基因治療等領域得到了日益廣泛的應用。但是，骨髓間充質干細胞在骨髓中含量稀少，僅占有核細胞總量的0.001% ～0.01%［4］，所以對其進行分離純化就顯得尤為重要。目前用于分離純化骨髓間充質干細胞的方法主要有全骨髓貼壁培養法、密度梯度離心法和免疫學方法等［5］。免疫學法有較高特異性，但所需成本高，在實際應用中受到限制。密度梯度離心法獲取的細胞活性下降、數量減少，不利于細胞的生長，因此，這兩種方法在應用中均受到不同程度的限制。本實驗采用貼壁法，選取新生兔，無菌條件下獲取股骨，進入骨髓腔得到細胞，將其離心后直接加入培養瓶中，為了去除原代培養中混雜的巨噬細胞、單核細胞、造血細胞和紅細胞等，利用BMSCs可在早期貼壁而血細胞不貼壁的特性，通過培養一定時間后更換細胞培養液來去除接種后混合細胞中未貼壁的血細胞，對于貼壁細胞，根據其粘附能力與骨髓間充質干細胞粘附能力不同，通過調整胰蛋白酶的消化時間，保證骨髓間充質干細胞在短時間內與培養瓶分離，而巨噬細胞、單核細胞和造血細胞等仍貼附于培養瓶底，來分離兔骨髓間充質干細胞。步驟簡單，易于操作，純化效果好。細胞形態均一。該培養方法簡單、有效，分離獲得細胞純度較高，細胞活性好。

本實驗對第1、3、5代的兔BMSCs的貼壁率及生長特性進行研究，發現第1代和第3代細胞的形態基本相同，貼壁率較高，細胞生長曲線也均為類S形。而第5代細胞在貼壁特性及增殖能力方面均較第1代和第3代有所降低，但變化不大。一般細胞生長均經歷了潛伏期、對數期和平臺期。這個現象提示在進行組織工程研究時最好選取第1至第3代的BMSCs作為種子細胞，以保證其與骨組織工程支架材料復合時獲得良好的固位。

目前沒有鑒定干細胞的統一標準，絕大部分的學者都是從細胞形態，細胞表型，細胞功能三大方面來檢驗干細胞特性［6］。實驗中發現，本方法培養的骨髓間充質干細胞是一種形態類似成纖維樣集落生長的細胞，與文獻報道一致［7］。對于干細胞的實際應用而言，是否保持多分化潛能至關重要。本實驗對分離到的細胞進行的成軟骨誘導，結果表明，采用我們的分離培養方法，骨髓間充質干細胞具有多向分化能力，完全能夠滿足應用的需要。

綜上所述，全骨髓貼壁法分離培養兔骨髓間充質干細胞是一種比較理想的分離、純化和擴增MSCs的方法，這為將骨髓間充質干細胞作為種子細胞，進一步定向誘導分化應用于組織工程生物材料構建奠定了基礎。

［1］ Boo L，Selvaratnam L，Tai CC，et al.Expansion and preservation of multipotentiality of rabbit bone-marrow derived mesenchymal stem cells in dextran-based microcarrier spin culture［J］.J Mater Sci Mater Med，2011，22(5):1343-1356

［2］ Seong JM，Kim BC，Park JH，et al.Stem cells in bone tissue engineering［J］.Biomed Mater，2010，5(6):11-33

［3］ 田詩政，楊志宏，馮國華，等.大鼠骨髓間充質干細胞體外培養和鑒定［J］.西部醫學，2011，23(12):2303-2306

［4］ 石 云，張曉英.小鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)的體外分離擴增及鑒定［J］.長治醫學院學報，2012，26(3):164-166

［5］ 黃家志，陳前芬，肖增明，等.兔骨髓間充質干細胞的體外分離培養及鑒定［J］.廣西醫科大學學報，2011，28(1):8-12

［6］ Kemp KC，Hows J，Donaldson C.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells［J］.Leuk Lymphoma，2005，46(11):1531-1544

［7］ Chanda D，Kumar S，Ponnazhagan S.Therapeutic potential of adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells in diseases of the skeleton［J］.J Cell Biochem，2010，111(2):249-257