T-bet、GATA-3、FoxP3 及 CDCD調節性T細胞在AA發病機制中的作用

沈紅石，陳海飛，任傳路，李征洋，唐杰慶，王 靜，吳天勤

(中國人民解放軍第100醫院，江蘇蘇州215007)

再生障礙性貧血(AA)是一種以全血細胞減少與骨髓造血功能衰竭為特征的骨髓造血系統疾病。其發病機制尚不十分清楚，免疫介導的造血抑制是AA最常見、目前研究最多的發病機制。已有研究表明，AA發生造血功能衰竭與細胞免疫功能異常、大量寡克隆淋巴細胞及/或自然殺傷細胞局部浸潤、多種細胞因子分泌失調及造血微環境受損等因素有關［1～3］，因此進一步了解AA的免疫發病機制對AA的臨床診斷及治療等方面有著重要的意義。T-bet、GATA-3分別為Th1、Th2細胞特異性的轉錄因子，FoxP3為調節性T細胞特異性的轉錄因子。本研究通過檢測AA患者外周血單個核細胞(PBMC)中轉錄因子 T-bet、GATA-3、FoxP3 mRNA的表達、血漿中Th1類細胞因子IFN-γ和Th2類細胞因子IL-4水平及AA患者外周血調節性T細胞水平，從轉錄因子水平為AA的臨床診斷和治療提供理論和實驗依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年1月～2011年5月我院血液科門診就診及病房中的患者27例(AA組)，其臨床骨髓細胞形態學、生化及細胞遺傳學檢查符合AA診斷標準［4］。其中男17例、女10例，年齡19～58(33±9.8)歲，病程5～235(20±17.6)個月。對照組選擇健康體檢者25例，其中男16例、女9例，年齡20～59(32±8.3)歲。

1.2 標本采集 AA組與對照組均抽取外周靜脈血8 mL，其中EDTA抗凝6 mL，肝素鈉抗凝2 mL。后者經培養16～20 h后用于T細胞亞群的檢測。EDTA抗凝外周血6 mL分離PBMC，提取總mRNA，-80℃低溫凍存備用。用于 T-bet、GATA-3和FoxP3的測定。

1.3 檢測方法

1.3.1 T-bet、GATA-3、FoxP3 mRNA的檢測 通過實時熒光定量PCR方法檢測這3種轉錄因子水平。TRIzol、FQPCR試劑盒均購自美國 Gibco-BRL，ABI7300型Real Time PCR檢測儀購自美國公司。通過美國生物技術中心GeneBank數據庫檢索T-bet、GATA-3、FoxP3、GAPDH mRNA 序列，利用美國Whitehead生物醫學研究所Primer3程序設計探針，參考文獻方法設計上下游引物，由上海申友生物技術有限公司合成。探針及引物序列見表1。實時定量FQ-PCR總反應體系25 μL，其中含2×Quanti Tect SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，樣品 cDNA 1.5 μL。反應條件:50 ℃2min，95 ℃15min;94 ℃15 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，50次循環。采用RG-3000實時監測定量RT-PCR儀。利用溶解曲線進行產物的特異性分析，采用Relative Quantification Software 1.0分析軟件進行分析，結果判斷以同時擴增的內參照GAPDH的表達強度為基準，表達強度以轉錄因子/GAPDH的基因拷貝數的比值來表示。

表1 T-bet、GATA-3、FoxP3及GAPDH探針及引物序列

1.3.2 T細胞亞群的檢測 抗體有FITC標記的鼠抗人 CD4、CD25、CD3抗體，PE 標記的 CD25，同型對照抗體為PE標記的鼠抗人IgG1免疫球蛋白、FITC標記的鼠抗人IgG1免疫球蛋白均為美國 BD公司產品。流式細胞術檢測人細胞。采靜脈血2 mL，肝素抗凝，兩倍體積的PBS稀釋，采用淋巴細胞分離液分離出外周血單個核細胞(PBMNC)，調整細胞密度至1×107/mL，各取PBMNC懸液10 μL于標本試管中，分別加入FITC標記的CD4和PE標記的CD25各20 μL，陰性對照管加入 FITC標記的CD4和PE標記的鼠 IgG1各20 μL，室溫避光孵育20min，加冷PBS洗滌1次，重新懸浮細胞后上流式細胞儀檢測。

1.3.3 血漿IFN-γ和IL-4的檢測 血漿IFN-γ和IL-4的測定，采用ELISA雙抗夾心法，操作按試劑盒說明，檢測試劑盒購自美國R＆D systems公司。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，計量資料以±s表示，組間比較用雙t檢驗，組間計數資料比較用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組轉錄因子T-bet、GATA-3、FoxP3 mRNA表達量比較 與對照組相比，AA組的T-bet mRNA相對表達量升高(P＜0.01)，GATA-3、FoxP3 mRNA相對表達量降低(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

表2 兩組轉錄因子T-bet、GATA-3、FoxP3 mRNA相對表達量比較(±s)

表2 兩組轉錄因子T-bet、GATA-3、FoxP3 mRNA相對表達量比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05，△P ＜0.01

組別 n T-bet GATA-3 FoxP3 AA組 27 4.78±1.24△ 1.08±0.12* 0.26±0.01△對照組25 1.12±0.17 1.27±0.41 1.31±0.11

注:與對照組比較，*P＜0.05，△P ＜0.01

2.3 兩組血漿IFN-γ和IL-4水平比較 AA組血漿中IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4高于對照組(P均＜0.01)。見表4。

表4 兩組血漿IFN-γ和IL-4水平比較(±s)

表4 兩組血漿IFN-γ和IL-4水平比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01

組別 n IFN-γ(pg/mL)IL-4(pg/mL) IFN-γ/IL-4對照組25 8.57±0.85 4.86±0.68 1.65±0.42 AA組 27 15.32±2.97* 5.42±0.49 2.54±0.46*

3 討論

AA的發病機制除與造血干細胞本身缺陷、造血微環境損傷有關外，免疫異常是一個絕對不可忽視的因素。現有學者認為，大多數患者發病與自身免疫反應導致的造血干細胞受損有關。國內外研究結果表明，AA患者外周血中Th1細胞及Th1/Th2均明顯高于正常對照人群［5］，即 AA患者 Th1、Th2之間的分化平衡被打破，并發展為Th1型優勢的免疫應答，存在Th1細胞的過度分化和Th1型細胞因子的過度分泌。研究發現，T-bet是Th1特異的轉錄因子［6］，不僅控制 Th1細胞特征性細胞因子 IFN-γ的表達，且抑制Th2細胞特征性細胞因子IL-4的合成［7］。GATA-3則是Th2細胞特異性轉錄因子，能抑制IFN-γ的表達，促進Th2細胞特征性細胞因子IL-4等的產生。FoxP3(叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子P3)是調節性T細胞特異性的轉錄因子，目前被公認為是調節性T細胞最具有特異性的分子標志物調節性T細胞能獨立表達Foxp3 mRNA。Foxp3對調節性T細胞是一正向調節蛋白，可以調節調節性T細胞的發育和功能效應，參與了免疫耐受的分子機制［8］。因此，細胞特異性轉錄因子T-bet、GATA-3與FoxP3共同調節Th細胞的極性分化。本研究結果顯示，與對照組相比，AA組的T-bet顯著升高，表明AA組患者PBMC中T-bet mRNA相對表達水平顯著高于對照組表達水平。GATA-3和FoxP3降低，表明AA組患者外周血單個核細胞GATA-3和FoxP3 mRNA相對表達水平顯著低于對照組表達水平。

本研究結果表明，AA存在T淋巴細胞亞群的功能紊亂及B淋巴細胞增殖活化;表現為調節性T細胞的減低，其特異性的轉錄因子FoxP3 mRNA表達下調，調節性T細胞的減少并由此引起免疫抑制效應不足可能是AA發生的重要原因之一，但AA發生、發展的詳細分子機制尚需進一步深入研究。

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