尿素包合法富集純化杜仲籽油α－亞麻酸的工藝優化

孫蘭萍，許 暉，馬 龍，趙大慶

(1.蚌埠學院應用化學與環境工程系，安徽蚌埠233000;2.蚌埠學院生物與食品工程系，安徽蚌埠233000)

杜仲是我國特有的木本植物和經濟林樹種。杜仲籽是杜仲種植業的副產品，我國現有杜仲種植面積超過30余萬公頃，杜仲籽資源十分豐富。杜仲籽的含油量一般在27%～33%，杜仲籽油中富含多不飽和脂肪酸，其中α－亞麻酸更是達61%～63%［1］，是迄今發現的一種與蘇籽油成分相仿的，高α－亞麻酸含量的天然植物油。在國外α－亞麻酸含量較多的亞麻籽油和紫蘇籽油已進入保健食品市場。德國、美國、日本等國也將α－亞麻酸及其衍生物作為藥物或食品添加劑，用來預防和治療高血壓、高血脂、癌癥等多種疾病。綜上所述，從杜仲籽中提取杜仲籽油，再對其中的α－亞麻酸進行純化富集，對杜仲深加工及杜仲資源綜合開發利用具有重大意義。α－亞麻酸的富集純化方法主要有低溫結晶法、尿素包合法、分子蒸餾法、銀離子絡合法、柱色譜法、吸附分離法、超臨界流體精餾法等［2］。其中，尿素包合法工藝簡單，操作簡便，包合過程在低溫和惰性氣氛下進行，確保了α－亞麻酸的生理活性。本實驗以尿素包合法富集純化杜仲籽油α－亞麻酸，采用二次正交旋轉組合設計，分析建立α－亞麻酸純度的二次多元回歸方程預測模型，以期為高含量α－亞麻酸的工業化生產提供理論依據。

表1 二次正交旋轉組合設計中各變量的編碼及因素水平Table 1 Codes and actual levels of independent variables in quadratic rotation－orthogonal combination design

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲籽油(α－亞麻酸含量58.86%)五臺縣五臺山沙棘制品有限公司(超臨界CO2萃取獲得);α－亞麻酸甲酯對照品 Sigma公司;NaOH、KOH、石油醚(30～60℃)、正己烷、尿素、無水乙醇、無水甲醇、95%乙醇、濃鹽酸、NaCl、無水硫酸鈉 均為分析純。

SP－6800A氣相色譜儀 山東魯南瑞虹化工儀器有限公司;UV1102紫外可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司;RE52CS旋轉蒸發儀 蘇州江東精密儀器有限公司;SHB－ⅢA循環水式多用真空泵 河南太康科教器材廠;FA2004電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;DZF－6051型真空干燥箱 上海三發科學儀器有限公司;DK－98－1型恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;冰箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 杜仲籽油混合脂肪酸的制備［3－8］稱取一定量的杜仲籽油，按1∶6(V/V)比例加入1.0mol/L的NaOH－乙醇溶液，置于500mL三口燒瓶中，在60℃的水浴中加熱回流(N2保護)，磁力攪拌1h，得皂化液，加入少量石油醚萃取除去不皂化物，冷卻至室溫后置于冰箱中，使皂析出，過濾得皂化物，加入適量水使生成的少量皂完全溶解，用6.0mol/L的HC1溶液酸化混合液至 pH2～3，加入石油醚，充分攪拌，靜置分層，分取上層石油醚相，水層加石油醚萃取3次，合并有機相。有機相以5%NaCl水溶液水洗至中性，加入無水硫酸鈉脫水，抽濾，旋蒸，回收石油醚，得到杜仲籽油混合脂肪酸。

1.2.2 α－亞麻酸含量的檢測方法——氣相色譜分析法［4，9－12］采用氣相色譜法測定樣品中的脂肪酸組成，以峰面積歸一化法計算α－亞麻酸的純度。

1.2.2.1 氣相色譜條件 HP－WAX柱(30m×0.25mm，0.5μm);載氣為高純氮氣，氮氣流速25mL/min;檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID)，氫氣流速30mL/min，空氣流速 300mL/min;柱溫:起始溫度200℃，恒溫2min，以15℃/min程序升溫至260℃，保持5min;進樣器溫度為260℃;檢測器溫度為260℃;分流比為 50∶1;進樣量 1.0μL。

1.2.2.2 杜仲籽油甲酯化 稱取約0.2g杜仲籽油置于25mL具塞試管中，加入2mL石油醚－苯(V∶V=1∶1)溶解，再加入0.2 mol/L KOH－甲醇溶液 5mL，于50℃水浴中震蕩反應30min，冷卻，加入2mL飽和NaCl溶液，混勻后靜置10min分層，取上清液，加入少量無水硫酸鈉，離心，取上清液。

1.2.2.3 混合脂肪酸甲酯化 取混合脂肪酸樣品0.2g，置于25mL具塞試管中，加入0.2mol/L KOH－甲醇溶液5mL，于50℃水浴中震蕩反應30min，冷卻，加入石油醚5mL、飽和 NaCl溶液2mL，震蕩10min，靜置分層，取上清液，加入無水硫酸鈉少許，離心，取上清液。

1.2.3 杜仲籽油 α－ 亞麻酸尿素包合方法［4－6，8，13－15］按實驗方案預先設定的比例，將一定量的尿素和95%乙醇加入到500mL三口燒瓶中，于60℃水浴中磁力攪拌并加熱回流，至尿素溶解完全后，加入一定量的已在60℃水浴中預熱過的杜仲籽油混合脂肪酸(N2保護)，反應混合物于60℃加熱回流并磁力攪拌至變成澄清透明溶液后，于室溫下冷卻30 min，后在預先設定的溫度下進行包合反應。包合一定的時間后取出迅速減壓抽濾，用95%的乙醇清洗結晶體，濾液移入分液漏斗，加入適量石油醚，用10%的HC1溶液酸化濾液至pH2～3，再加入適量水，充分萃取，分取有機相，用石油醚多次萃取水相，棄去水層，合并有機相，有機相以5%NaCl水溶液水洗至中性，加入少量無水硫酸鈉脫水，抽濾，旋轉蒸發回收溶劑，得到富集的不飽和脂肪酸。

1.2.4 杜仲籽油α－亞麻酸尿素包合工藝的優化根據前期單因素實驗的結果，分別選取尿素與脂肪酸質量比、95%乙醇與脂肪酸質量比、包合溫度以及包合時間為4個實驗因素，以α－亞麻酸純度為考察指標，采用二次正交旋轉組合設計，設計4因素4水平的二次正交旋轉組合實驗，以優化確定最佳尿素包合工藝參數。確定尿素與脂肪酸質量比(X1)、95%乙醇與脂肪酸質量比(X2)、包合溫度(X3)以及包合時間(X4)的零水平分別為 3∶1、8∶1、0℃ 和 16h。二次正交旋轉組合設計中各變量的編碼和相應的因素水平值見表1。采用DPS 7.05數據處理軟件對實驗結果進行統計分析，并進行工藝參數優化。

2 結果與分析

2.1 二次正交旋轉組合設計實驗結果

二次正交旋轉組合設計實驗方案及結果如表2所示。

2.2 回歸模型方程的建立與顯著性檢驗

采用DPS 7.05數據處理軟件對表2中的實驗結果進行二次多項式逐步回歸分析，計算出回歸模型方程的各項系數，從而得到α－亞麻酸純度(Y)的回歸模型方程如下:

表2 二次正交旋轉組合設計實驗方案及結果Table 2 Quadratic rotation－orthogonal combination experimental design scheme and results

為檢驗回歸模型方程(1)的有效性，按F1=失擬均方/誤差均方，F2=回歸均方/剩余均方，進行二次F檢驗。實驗結果方差分析如表3所示。

由表3可知，回歸模型方程的失擬性檢驗F1=2.57135 ＜F0.05(10，11)=2.85 及 F0.01(10，11)=4.54，失擬不顯著，說明所建立的二次回歸模型是適當的，模型方程與實際情況擬合較好;回歸方程顯著性檢驗F2=25.02630＞F0.01(14，21)=3.07及 F0.05(14，21)=2.20，檢驗極顯著，說明該模型方程與實際情況吻合很好，模型成立。對回歸系數進行顯著性檢驗，在α=0.05顯著水平剔除不顯著項后，得到簡化后的回歸模型方程為:

2.3 回歸模型方程的解析

2.3.1 單因素效應分析 采用降維分析法，將回歸得到的簡化模型方程(2)的四個因素中任意三個固定在零水平，對單因素進行效應分析，結果見表4及圖1。

表4 單因素效應分析Table 4 Effective analysis of single factor

圖1 各單因素與α－亞麻酸純度(%)關系曲線Fig.1 The relationship curves of single factors to the purity of α－linolenic acid(%)

由表4及圖1可知，尿素與脂肪酸的質量比(X1)、95%乙醇與脂肪酸的質量比(X2)以及包合時間(X4)3個影響因素在－2到2水平上變化時，α－亞麻酸純度首先隨著因素水平值的增加而增加，至最大值后，又隨著因素水平值的進一步增加而有所減小;而包合溫度(X3)影響因素在－2到－1水平上時，隨著因素水平值的增加，α－亞麻酸純度呈小幅度緩慢上升，包合溫度變化對α－亞麻酸純度的影響不太明顯，在－1到2水平上時，隨著包合溫度因素水平值的增加，α－亞麻酸純度則明顯下降。上述各單因素變化趨勢與前期單因素實驗的結果基本吻合。

此外，由圖1可知，在處于－2～2水平區間時，各影響因素 X1、X2、X3、X4與 α－亞麻酸純度關系曲線中，包合溫度(X3)與α－亞麻酸純度的關系曲線最接近線性關系，表明包合溫度(X3)對α－亞麻酸純度的影響最為顯著，與由表3中F值導出的結論一致。由表3中F值大小可知，各影響因素 X1、X2、X3、X4對α－亞麻酸純度影響的主次順序依次為:包合溫度(X3)＞95%乙醇與脂肪酸的質量比(X2)＞尿素與脂肪酸的質量比(X1)＞包合時間(X4)。

表3 二次正交旋轉組合設計實驗結果方差分析Table 3 Variance analysis for the experimental results of quadratic rotation－orthogonal combination design

表5 各變量Xi取值頻率分布Table 5 Probability distribution of each variable Xi

2.3.2 各因素之間的兩兩交互作用效應分析 將回歸得到的簡化模型方程(2)的四個因素中任意兩個固定在零水平，考察四個因素中兩兩間的交互作用，可分別做出其相應的響應面圖。

觀察各相應面圖并結合表 3中 X1X2，X1X3，X1X4，X2X3，X2X4，X3X4各項 p 值的大小可知，回歸得到的模型方程(1)中，具有顯著性(p＜0.05)的交互作用項僅有X1X3，見圖2。由圖2可知，在尿素與脂肪酸的質量比(X1)一定時，隨著包合溫度(X3)的逐漸升高，α－亞麻酸純度先短暫小幅度緩慢上升后即大幅度明顯下降，表明包合溫度的改變對α－亞麻酸純度的影響顯著，隨著包合溫度的升高，α－亞麻酸純度整體上呈下降趨勢。而在一定包合溫度下，隨著尿素與脂肪酸質量比的增加，α－亞麻酸的純度也相應增加，但α－亞麻酸的純度增至最大值后，隨著尿素與脂肪酸質量比的進一步增大，α－亞麻酸的純度則反而有所下降。當尿素與脂肪酸的質量比(X1)位于－1.5～1.5 水平，包合溫度(X3)位于－2～－0.5 水平時，α－亞麻酸的純度相對較高。

2.4 包合工藝參數的優化

為了獲得最佳包合工藝參數，對實驗數據進行頻數分析。選取α－亞麻酸純度大于78.01%的139個方案進行頻數分析，得到95%的置信區間如表5所示。

圖2 尿素與脂肪酸的質量比(X1)與包合溫度(X3)的交互作用Fig.2 The interaction of urea－fatty acid ratio(X1)and inclusion temperature(X3)

由表5可知，尿素包合法富集純化α－亞麻酸的最佳包合工藝參數范圍分別為:尿素與脂肪酸質量比為2.936∶1～3.143∶1，95% 乙醇與脂肪酸質量比為9.118∶1～9.76∶1，包合溫度為－10.75～－7.81℃，包合時間為16.656～17.816h。在此包合參數范圍內，富集純化獲得的α－亞麻酸的純度均大于78.01%。考慮到生產實際的可操作性，可將最佳包合工藝條件定為:尿素與脂肪酸質量比為3∶1，95%乙醇與脂肪酸質量比為9∶1，包合溫度為－9.0℃，包合時間為17.0h。

2.5 回歸模型方程的驗證

為檢驗二次正交旋轉組合設計分析得到的回歸模型方程的可靠性，選取優化獲得的最佳包合工藝參數進行3組平行驗證實驗，并在對應條件下用回歸方程(2)求出α－亞麻酸純度的理論預測值，與實驗實測值比較。結果見表6。

由表6可知，實驗實測值與理論預測值相比，其平均絕對誤差僅為－0.98%。驗證實驗結果表明，利用二次正交旋轉組合設計回歸得到的模型方程是可靠的，其擬合結果具有一定的實踐指導意義。

表6 驗證實驗結果Table 6 Results of validation expertments

3 結論

3.1 杜仲籽油富含α－亞麻酸，是α－亞麻酸的理想來源。本研究首次嘗試利用杜仲籽油生產高α－亞麻酸含量的產品，為α－亞麻酸保健品的生產及杜仲籽的深加工及綜合利用提供了新的途徑。

3.2 實驗結果表明，尿素包合法富集純化杜仲籽油α－亞麻酸的最佳工藝條件是:尿素與脂肪酸質量比為3∶1，95%乙醇與脂肪酸質量比為9∶1，包合溫度為－9.0℃，包合時間為17.0h。最佳包合工藝條件下，α－亞麻酸的純度可達 82.63%，與理論預測值83.61%相比僅相差－0.98%。

3.3 本純化富集工藝簡單，條件溫和，且所用試劑價廉易得，均可回收再利用，較適合于工業化大規模生產，但若要進一步提高α－亞麻酸純度，獲得高純度的α－亞麻酸，生產中還需將不同純化方法進行組合優化。

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