黃芪甲苷單克隆抗體的制備及鑒定

于生蘭，歐陽臻 ，徐加兵，王帥兵

1江蘇大學食品與生物工程學院，鎮江212013;2江蘇農牧科技職業學院，泰州225300;3江蘇大學藥學院，鎮江212013

黃芪甲苷(AstragalosideⅣ，簡稱AST)是中藥黃芪藥理活性的主要物質之一，為黃芪及其制劑質量鑒定的指標成分。藥理研究表明:AST具有調節機體免疫力、保護組織器官、降低血糖、抗細胞凋亡和抗炎抗病毒等多方面的作用，具有非常廣闊的發展前景［1］。目前檢測AST的方法有高效液相色譜法(HPLC)、薄層掃描法(TLCS)、比色法、熒光法等，但這些方法或者操作復雜，靈敏度低，或者分析成本高，耗時長。基于抗原抗體反應的酶聯免疫檢測(ELISA)是一種新型的分析方法，可以有效解決傳統方法所存在的問題。本實驗采用人工合成的方法制得AST與牛血清白蛋白(BSA)的免疫抗原(ASTBSA)，通過細胞融合制備McAb。旨在為ELISA法檢測中藥黃芪及其制劑中黃芪甲苷的含量奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

AST標準品(含量98%，HPLC)，成都曼思特生物科技有限公司;牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FICA)均來自Sigma公司;羊抗鼠酶標抗體，武漢博士德生物有限公司;Balb/c小鼠，雌性，體重16～18 g，揚州大學實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(蘇)2012-0004。

1．2 儀器

CO2培養箱(NUAIRE);MALDI-TOF/TOF質譜儀(Applied Biosystem，4800型);普通、高速離心機(Labnet);超低溫冰箱(Heto);生物顯微鏡(OLYMPUS);酶標儀(BIO2TEK);微量移液器。

1．3 方法

1．3．1 AST-BSA人工抗原的合成與鑒定

1．3．1．1 AST-BSA 人工抗原的合成

將AST的甲醇溶液(濃度為8 mg/mL)逐滴加入NaIO4溶液內(濃度為12．5 mg/mL)，攪拌1 h后，再慢慢加入含有BSA的50 mmol/L(pH 9．6)的碳酸緩沖液(BSA 10 mg溶于碳酸緩沖液2．8 mL)，用1 mol/L的Na2CO3調整反應混合液的pH值至9．0，于室溫下攪拌6 h后，將反應液對蒸餾水透析3 d，再經凍干處理，即得到AST-BSA復合物［2］。

AST-OVA采用同樣的方法合成。

1．3．1．2 AST-BSA 人工抗原的鑒定(基質輔助激光解析電離飛行時間質譜法)

經ZipTip C4脫鹽處理后取1μL蛋白樣品點至樣品靶上，自然干燥后，再取0．6μL SA基質溶液點至對應靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰位置點標準品。

在正離子模式下選擇線性方法對樣品測試范圍進行校準測試。標準物質校準范圍為:39212±100、66430±100。在正離子模式下選擇線性方法測試樣品分子量。根據分子量測定結果，計算偶聯比。

偶聯比=(MrAST-BSA-MrBSA)/MrAST［3］

1．3．2 分泌抗AST雜交瘤細胞株的建立［4］

以50μg AST-BSA(溶于150μL PBS)與完全福氏佐劑1∶1混勻成乳液，腹腔注射Balb/C小鼠(3只，6周齡)，間隔2周，腹腔注射交聯抗原AST-BSA(與第一次比例相同，弗氏完全佐劑換成弗氏不完全佐劑)，追加免疫3次，2周后，末次加強免疫。3d后取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)進行融合。SP2/0細胞(1×107)與免疫鼠脾細胞(1×108)按1∶10的比例混合，加入 0．5 mL 50%PEG-4000進行融合。融合后細胞轉入含飼養細胞的96孔細胞培養板中，于37℃，5%CO2培養箱中培養;3 d后，加入HAT培養基進行選擇培養。用間接酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測抗體，選擇抗體分泌陽性孔，采用有限稀釋法，接種于96孔培養板內，選擇單個細胞集落孔的培養上清作抗體檢測，陽性者用同樣方法再次克隆，直至克隆后有雜交瘤細胞生長的抗體分泌陽性率為100%。

1．3．3 單克隆抗體的大量制備與鑒定

取12周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟(每只0．4 mL)。1周后每只小鼠腹腔注射5×105個雜交瘤細胞，待小鼠腹部明顯隆起時(注射后約10 d)收集腹水，2000 rpm離心10 min，吸取上清分裝，-20℃凍存。采用辛酸-飽和硫酸銨沉淀法純化腹水，腹水效價測定用間接ELISA方法［5］。

1．3．4 單克隆抗體的特異性檢測

用間接競爭ELISA法檢測抗體特異性［6］，包被抗原為AST-OVA。根據OD450判定所產生的抗體的特異性。

2 結果與分析

2．1 人工抗原AST-BSA偶聯比的確定

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜結果見圖1(A)、(B)。測定結果表明:BSA分子量為66446．4766;AST-BSA偶聯物分子量為76970．9609，計算出其偶聯比為(76970．9609-66446．4766)/784．97≈13。

2．2 單克隆雜交瘤細胞株的制備與鑒定

取免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，融合后共接種5塊板，其中10孔加對照細胞(骨髓瘤細胞)，故融合細胞接種孔數為470個，培養后有雜交瘤細胞克隆生長孔數目為325孔，融合率為69．2%。第1次用間接ELISA法篩選，獲得陽性孔為94孔，故第1次篩選的陽性率為20．0%。

將獲得的94孔雜交瘤細胞再進行亞克隆，并經過ELISA篩選和鑒定，獲得了23個陽性雜交細胞亞克隆細胞株。對雜交瘤細胞培養的上清液進行間接ELISA檢測，取效價高且特異性強的陽性孔雜交瘤，采用有限稀釋法進行克隆，經過3次亞克隆和篩選，最后獲得了2株能穩定分泌抗AST單克隆抗體的雜交瘤細胞，分別命名為1D5、3D11(細胞培養見圖2)。

3 討論

3．1 人工抗原的合成與鑒定

作為一個完全抗原必須同時具備T細胞和B細胞表位。小分子物質由于分子太小一般難以同時擁有兩個表位，必須將其連接到一些大分子蛋白載體以形成偶聯物，借助大分子T細胞表位間接誘導B細胞激活、分化增殖，產生針對半抗原的特異性抗體［7］。AST是一種含糖半抗原，對于半抗原與載體的偶聯，傳統的人工抗原的合成方法有混合酸酐法、活潑酯法、碳二亞胺法及高碘酸鈉法。本實驗參考人參皂苷單克隆抗體的制備采用高碘酸鈉法［2］，結果表明合成效率較高，合成方法簡便可行。

3．2 動物免疫實驗

本實驗制備單克隆抗體的目的是為了建立中藥黃芪及其制劑中黃芪甲苷的ELISA檢測方法，要求單克隆抗體有較高的親和力，所以選擇了皮下注射與腹腔注射相結合，并制定了小劑量、長周期、多次數的免疫方案，使得含黃芪甲苷的抗原分子產生了很強的免疫原性。小鼠免疫間隔時間為2周，融合前3 d不加佐劑直接用AST-BSA進行強化免疫，其目的是促進小鼠脾臟內正處于增殖狀態的B淋巴細胞數量達到最多。結果表明，選擇的實驗動物個體、數量及其免疫方案是可行的，免疫效果理想。

3．3 間接ELISA方法建立

本實驗對間接ELISA反應條件進行了探索，建立了靈敏、特異、操作簡單、適于大批量含黃芪甲苷成分含量的檢測方法，為黃芪藥材及其制劑中黃芪甲苷的免疫檢測方法奠定了基礎。作者下一步將對建立的檢測方法的靈敏度、交叉反應等進行研究，為以后研制適合黃芪甲苷的檢測試劑盒奠定基礎。

1 Duan LJ(段立軍)，Sun BH(孫博航)．Research reviews on astragaloside．J Shenyang Pharm Univ(沈陽藥科大學學報)，2011，28:410-416．

2 Zhao SJ(趙壽經)，Hou CX(侯春喜)，Qian YC(錢延春)，et al．Preparation and identification ofmonoclonalantibody against ginsenoside Rb1．J Jilin Univ，Eng Technol Ed(吉林大學學報，工程技術版)，2007，37:245-248．

3 Yang XP(楊新平)，Chen X(陳旭)，Li FY(李芳耀)，etal．Synthesis and identification of artificial antigen for curcumol，an antitumor compounds from Rhizoma Zedoariae．Lishizhen Med Mater Med Res(時珍國醫國藥)，2010，21:1054-1056．

4 Boesen HT，Jensen TK，Jungersen G，et al．Development，characterization and diagnostic application of a monoclonal antibody specific for a proteinase K resistant Lawsonia intracellularis antigen．Veterin Microbiol，2005，105:199-206．

5 Shin GC，Chung YS，Kim IS，etal．Preparation and characterization of a novel monoclonal antibody specific to severe acute respiratory syndrome-coronavirus nucleocapsid protein．Virus Res，2006，122:109-118．

6 Xiong W，Huang WW，Jiao Y，et al．Production，purification and characterization ofmouse monoclonal antibodies against human mitochondrial transcription termination factor 2(MTERF2)．Protein Exp Purif，2012，82:11-19．

7 Guo X(郭旭)，liu JH(劉吉華)，Yu BY(余伯陽)．Preparation and application ofmonoclonal antibody against bioactive compound of Chinese herbalmedicine．JNanjing Xiaozhuang Univ(南京曉莊學院學報)，2010，5:31-36．