腸炎寧片高效液相色譜指紋圖譜研究

邢占芬，成洪達，張平平

山東萬杰醫學院藥學系，淄博 255213

腸炎寧片由地錦草、金毛耳草、香薷、楓香樹葉、樟樹根五味中藥材組成，具有清熱利濕、行氣的功效，用于急、慢性胃腸炎，腹瀉，細菌性痢疾，小兒消化不良等癥［1］。經文獻查閱，目前腸炎寧片的質量控制僅采用高效液相色譜法測定單一有效成分如沒食子酸、雞屎藤苷甲酯含量［2，3］，由于中藥復方化學成份繁多，藥效復雜，僅以某種有效成份含量作為質量控制指標是不全面的。本實驗采用HPLC對腸炎寧片指紋圖譜進行了研究，以達到全面控制其質量的目的。

1 儀器與試劑

大連依利特P1201型高效液相色譜儀(UV檢測器1臺，高壓恒流泵2臺，柱溫箱，EC2006工作站);上海精密科學儀器有限公司FA1004N型電子天平;天津奧特賽恩斯儀器有限公司AS3120型超聲清洗機。甲醇為色譜純，水為超純水，槲皮素對照品購自中國藥品生物制品鑒定所，11批腸炎寧片購自江西天施康弋陽制藥有限公司。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

取槲皮素對照品適量，精密稱取9.7 mg于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度。

2.2 供試液的制備

取腸炎寧片6片，研細混勻，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，稱重，超聲提取30 min，放冷，加入甲醇補足失重。搖勻，過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 色譜條件

Hypersil BDS色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流動相以甲醇(A)-水(B)進行梯度洗脫，0～55 min，A:2% ～100%，55 ～62，A:100%，流速 1.0 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫30℃，進樣體積20 μL。

2.4 精密度試驗

取同一供試品(批號110746)溶液，在上述色譜條件下連續進樣6次，考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的一致性，結果表明，各共有峰的相對保留時間的RSD均小于2.0%，相對峰面積的RSD均小于3.0%，進樣精密度良好，符合指紋圖譜技術要求。

2.5 穩定性試驗

取同一供試品(批號110746)溶液，分別于0、2、4、6、24、48 h進樣，在相同色譜條件下記錄色譜圖，結果表明，各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，供試品溶液在48 h內穩定。

2.6 重復性試驗

取同一批次的供試品(批號110746)溶液5份，按上述色譜條件進行測定，結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD均小于3.0%，相對峰面積的RSD均小于3.0%，重復性良好。

3 腸炎寧片指紋圖譜的建立及分析

3.1 腸炎寧片指紋圖譜的建立

按上述方法檢測11批腸炎寧片的指紋圖譜，見圖1，11批樣品共獲得21個共有峰。

以槲皮素(18號峰)為參照，將其保留時間定為1，計算各峰的相對保留時間，數據見表1。

表1 11批腸炎寧片共有峰相對保留時間Table 1 Relative retention time of common-peak of 11 batches Changyanning tablets

3.2 指紋圖譜相似度評價

應用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004 A)”對11批腸炎寧片進行質量評價。將11批樣品色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004 A)”，以批號110746的腸炎寧片圖譜為參照譜，生成腸炎寧片共有模式的對照指紋圖譜(見圖2)，得出11批樣品譜圖與對照譜圖的相似度數據(見表2)，以均值法計算相似度均在0.95以上，符合指紋圖譜技術要求，結果見表3。

表2 11批次的腸炎寧片相似度計算Table 2 The calculation of similarity of 11 batches Changyanning tablets

表3 11批腸炎寧片相似度數據Table 3 Similarity of 11 batches Changyanning tablets

4 討論

4.1 提取方法的考察

本實驗分別采用甲醇、50%甲醇-水作溶劑進行超聲提取，結果表明，用甲醇做提取溶劑，色譜圖包含的色譜峰較多，色譜峰分離較好，故選用甲醇作為提取溶劑。

4.2 色譜柱的考察

考察了供試液在同規格Hypersil ODS C18色譜柱和Hypersil BDS C18色譜柱上的分離情況，兩種色譜柱分離結果差異較大，Hypersil ODS C18色譜柱分離情況較差，Hypersil BDS C18色譜柱色譜圖基線平穩，出峰較多且分離度好，故選用Hypersil BDS C18色譜柱，色譜柱規格4.6 mm ×250 mm，粒徑5 μm。

4.3 流動相的考察

比較了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%冰醋酸溶液流動相系統，結果表明，甲醇-水體系分離的效果較好。經比較洗脫條件，最終確定采用甲醇(A)-水(B)體系梯度洗脫。

4.4 檢測波長的選擇

結合文獻對地錦草、香薷研究所使用的檢測波長(分別 269、345 nm)［4-7］，在200 ～ 360 nm 波段內依次對樣品進行 230、254、269、300、345、365 nm 六個波長的特征譜圖分析，綜合考察色譜峰數及響應值，樣品在254 nm下指紋圖譜色譜峰數較多，色譜峰分布均勻，各指紋峰均有較大吸收，能全面反映樣品成分的信息特征，因此，確定試驗檢測波長為254 nm。

中藥復方由多味藥材組成，化學成分繁多，其多樣性與復雜性是其發揮療效的物質基礎，同時也是質量評價的難點與重點。目前，大量中藥僅以某種或幾種有效成份含量作為質量控制指標，方法簡單、單一，無法真正體現中藥的整體特征及內在質量。

本實驗建立了腸炎寧片HPLC指紋圖譜，確定了21個共有峰，共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD值均在3%以內，利用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A)”計算指紋圖譜的相似度，結果均在0.95以上，所建立的方法穩定、可靠，可用于腸炎寧片的質量評價。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，71.

2 Li J(李晶)，Li CT(李才堂)，Zhou GP(周國平)，et al.Quality standard of Changyanning tablet.Chin J New Drugs(中國新藥雜志)，2010，19:68.

3 Yu DF(余德發)，Wang ZQ(王志琴)，Cao JG(曹建國)，et al.Determination of kaempferide in Changyanning tablets by HPLC.J Jiangxi Univ Tradit Chin Med(江西中醫學院學報)，2003，15(2):56.

4 Chen GS(陳根順)，Li P(李鵬)，Xu LF(徐麗芳).Study on fingerprints on Chinese Mosla Herb by HPLC.Changyanning tablets.Chin Arch Tradit Chin Med(中華中醫藥學刊)，2009，27:772.

5 Tan XF(譚秀芳)，Li XJ(李曉瑾)，Wang Q(王強)，et al.HPLC fingerprint spectrum of Uighur Herba Euphorbiae Humifusae.Chin Wild Plant Res(中國野生植物資源)，2011，30(3):47.

6 Li P(李萍).HPLC for content measurement of quercetin in Hedyotis chrysoticha.J Guang Dong Coll Pharm(廣東藥學院學報)，2006，2:57.

7 Ji L(吉力)，Wang F(汪芳)，Liu YY(劉元艷).Determination of carvacrol and thymol in Mosla chinensis by HPLC.Chin J New Drugs(中國新藥雜志)，2004，29:1030.